脊髄介在神経系の成長円錐の誘導機序の器官培養法による解明

利用器官培养方法阐明脊髓中间神经元系统的生长锥诱导机制

基本信息

批准号：
06780629
负责人：
八木沼洋行
金额：
$ 0.77万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780629/
关键词：
神経発生脊髄ニワトリ器官培養コラーゲンゲル

项目摘要

年度前半で、脊髄外植体の培養条件の決定、年度後半に直視下での経時観察を行うことを目標に研究を進めたが、結果的には培養条件の決定に手間取り、直視下観察までは至らなかった。外植体の培養条件の決定:培養条件を様々に設定し、孵卵3日から4日のニワトリ胚の脊髄を取り出して1日から1日半培養し、組織の状態や神経経路の発生の具合を検討した。外植体を埋め込むコラーゲンゲルは規程の濃度から2倍希釈まで試したが、適度な濃度は1.5倍希釈前後が適当であることがわかった。培養液はF12の無血清培地に各種の栄養素を添加したものとF12に馬血清を5%ほど加えたものを試したが、神経系の発達に対する違いは見られなかった。しかしどちらの培養液でも神経管の両側の間葉組織中に培養一日目でかなりの細胞死がみられることから、さらにニワトリ胚抽出液などを加えることが必要であると思われる。培養一日後の取り出された神経組織は、外見は概ねその構造を維持しているように見られたが、組織切片の精査の結果、神経管の底板領域の変形が脊策を取り去った例に多く見られた。神経経路の発達を見るためにDilや抗チュブリン抗体で染色したところ、ほぼ正常と見られる成長円錐を伴った軸索像が見られ、培養条件下でも軸索伸展は起きているものと思われた。しかしながらその発達度合は生体内のものと比べて遅れていた。また底板領域で軸策の伸長が止まっているような所見が得られた。おそらく底板領域の微妙な構造の変化が成長円錐の底板領域の通過に影響を与えているものと思われる。今後もさらに培養条件の検討が必要であるとともに、観察対象をもう少し遅い時期にするような工夫も必要であると思われる。直視下経時観察:培養条件の決定と平行して共焦点顕微鏡による経時的観察の方法を検討した。コラーゲンゲルに埋まった外植体は液浸レンズを装着した共焦点顕微鏡で観察が可能であった。Dilを注入された外植体には2-3時間後には標識された成長円錐が観察された。数時間後に再び観察をすると、軸索が伸展した像も見られたが、いっぽう軸索の縮退したような像も見られた。これはおそらく観察時の低温やレーザー光によって傷害されたものと考えられる。今後さらに傷害を防ぐような工夫が必要と思われる。

在今年的上半年，我们进行了研究，目的是确定脊髓的培养条件，并在本年度下半年观察，但结果，确定培养条件和培养时间需要时间。直接观察。外部植物身体的培养条件的决策：以各种方式设置培养条件，将鸡肉胚胎的脊髓从3到4天，培养一天至半天，并产生组织和组织状况考虑到神经路径。嵌入外部植物的胶原蛋白凝胶已从规则的浓度到两次测试，但发现中等浓度在1.5次之前和之后是合适的。尝试将培养溶液添加到F12养分中，并以约5％的含量添加F12，但神经系统的发展没有差异。但是，在两种培养溶液中，在神经管两侧的叶组织的培养第一天都可以看到相当大的细胞死亡，因此有必要添加鸡肉胚提取物。在培养物似乎保持其结构之后的一天，由于对组织中断的审查，神经组织的结构似乎主要保持，神经管的底部板块面积的转化使我看到了它很多。染料和抗元二抗抗体可见神经途径的发育。但是，与活体中的发展程度相比，发展程度延迟了。此外，还有一个发现轴向测量在底板区域停止了。底部板区域的细微变化也可能影响了生长的锥形锥体区域的通过。将来，有必要考虑将来的文化条件，并且有必要设计一种方法来使观察稍后。在分包商的直接视图中观察：与培养条件的决策并行，使用了使用CO-焦点显微镜进行过度提高观察的方法。可以使用配备液态透镜的Co -opocus显微镜观察到胶原蛋白凝胶中的外部植物。在DIL注射的情况下，在2-3小时内观察到标记的生长锥体。几个小时后，当我再次观察到它时，轴的某些图像被扩展了，但是一些图像似乎已撤退。在观测和激光光期间，低温可能会受到伤害。有必要更多地设计以防止未来的伤害。