発生早期におこる標的非依存性運動神経細胞死の機序の解明

阐明发育早期发生的目标独立运动神经元死亡的机制

基本信息

批准号：
09280203
负责人：
八木沼洋行
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09280203/
关键词：
p75 NGF C-JUN カスパーゼ Bcl-2 ニワトリプログラム細胞死アポトーシス

项目摘要

本研究では、ニワトリの頚髄前角で孵卵4日から5日にかけて起こる神経細胞死において死ぬべき細胞がどのようにして決定されるのか、また、細胞死の実行機序としてはどのような分子メカニズムが働いているのかを明らかにすることを目的とし、(1)生き残る細胞と死ぬ細胞とを分ける何らかの分子マーカーはないか検索する(2)細胞死関連分子の影響を調べるの2点について研究を行なった。(1)trkA,trkB,trkCおよびp75に対する免疫組織化学を細胞死の起こる直前の時期(孵卵3.5-4日)に行なった。GDNFのレセプタであるretについては、ジゴキシゲニン標識のRNAプローブを作製しin situ hybridizationを行なった。これらの結果、trkA,trkB,trkCについてはいずれも細胞死の開始時期直前には特異的な発現は見られなかった。低親和性NGFレセプター(p75)とretは前角全域に強い陽性反応が見られたが、各細胞間に大きな違いは見られなかった。p75の強い発現が見られたことからp75やNGFの機能阻害抗体を投与して細胞死への影響を検討したが、有意の影響は見られなかった。このほか、検索の結果、c-JUNがこの頚髄の細胞死の極早期のマーカーとしてTUNEL反応より優れていることが明らかとなり、今後の応用が期待される。(2)細胞死抑制機能をもつBcl-2をアデノウイルスベクタを用いて強制発現させた。孵卵3.5日の頚髄腹側にウイルス液を注入し、4.5日に固定したところ、注入部位に遺伝子発現が認められた。しかしながら、発現の割合は3-40%程度にとどまり、定量的な作用の評価はできなかった。またIL-1β変換酵素(ICE)ファミリー(カスパーゼ)の関与を調べるため、細胞死が起きている部位を実体顕微鏡下に切り出して蛋白を抽出し、各カスパーゼに特異的な基質の分解量をはかることにより酵素の活性を測定した。この結果、DEVDを特異的に分解するカスパーゼ3様の活性が部位特異的、時期特異的に頚髄前角領域で上昇していることが明らかとなった。現在、外植体培養の系で各カスパーゼ阻害剤の影響を調べている。

这项研究旨在澄清如何在鸡前颈脊绳中孵育4到5天之间的神经元细胞死亡中确定如何确定的细胞，以及哪些分子机制在细胞死亡的功能上，并研究了两个点：（1）搜索将生存的细胞和垂死细胞和（2）摩尔（2）造成的造成的分子标记物，并检查了造成的造成效应。（1）TRKA，TRKB，TRKC和P75的免疫组织化学在细胞死亡之前的时间进行（3.5-4天孵育）。对于RET，制备了GDNF的受体，制备了二高辛蛋白标记的RNA探针，并进行原位杂交。结果，在细胞死亡开始之前，未观察到TRKA，TRKB和TRKC的特定表达。低亲和力NGF受体（P75）和RET在整个角度显示出强阳性反应，但在细胞之间没有发现显着差异。由于观察到p75的强表达，我们通过施用抗体抑制p75和NGF功能的抗体来研究对细胞死亡的影响，但没有发现显着影响。此外，搜索表明，C-Jun比TUNEL反应优于颈椎中这种极早的细胞死亡的标志，并且预计将来会应用。（2）具有细胞死亡抑制功能的Bcl-2被迫使用腺病毒载体表达。在3.5天孵育中，将病毒液注射到颈椎的腹侧，并在4.5天内固定，在注射部位观察到基因表达。但是，发病率仅约为3-40％，无法评估定量效应。为了研究IL-1β转化酶（ICE）家族（caspase）的参与，在立体显微镜下将发生细胞死亡的部位切割出来以提取蛋白质，并通过测量特定于每个caspase的底物的降解量来测量酶活性。结果，据揭示了caspase-3样的活性（特别降解DEVD）在颈椎的前角区域中特定于位点特定且定期升高。目前，我们正在研究每个caspase抑制剂在Epplant培养系统中的影响。