歯周病原菌の細胞内侵入性および増殖性に関する免疫細胞化学的手法による電顕的研究

免疫细胞化学技术对牙周病原菌细胞内侵袭和增殖的电镜研究

• 批准号: 05857201
• 负责人: 葛城 :啓彰
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: The Nippon Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857201/
• 关键词: マクロファージ; P.gingivalis; PKH-2; DCFH-DA; BCECF-AM

ヒト歯周病で主要な病原菌であるP.gingivalisが,ヒトマクロファージ培養系で如何なる動態を示すかを生細胞標識蛍光色素PKH-2,DCFH-DC,BCECF-AMを用いて検討した結果以下の知見が得られた。(1)PKH-2標識菌体による経時的検討:ヒトマクロファージにPKH-2標識P.gingivalis菌体を加え培養し経時的に,抗マクロファージモノクロナール抗体Leu-M3,抗補体レセプターモノクロナ-ムCR3抗体で染色しフローサイトメトリーによる解析の結果,Leu-3M+,PKH-2+細胞率は4時間:61.2±15.5%,24時間:30.7±10.2%,96時間:68.7±11.5%であり24時間で減少し96時間では4時間と同程度認めた。この所見は培養96時間の電顕所見で細胞内に菌体の存在が確認された所見と一致する。一方,CR3+細胞率は4時間:63.5±7.0%,24時間:40.7%±12.0,96時間:24.3±10.5%でCR3の発現は減少傾向にあった。(2)培養上清中のNO産生能の検討:(1)の実験培養上清中のNOラジカル産生をGriesseの方法に従い測定した結果,P.gingivalisでは6〜12時間:検出不可,24時間:0.05±0.02muM,48時間:0.03±0.02muM,72時間0.05±0.03muM,96時間:検出不可であり,F.nucleatum(F.n)との培養系72時間:0.2muMと比較して持続的低値を示した。(3)dichlorofluoresscin-diacetate(DCFH-DA)による活性酸素産生の検討:マクロファージ内活性酸素産生能は,DCFH-DCを用いたフローサイトメトリー解析の結果,活性酸素産生細胞率はP.gingivalis刺激で60分:22.0±5.6%,90分:15.7±6%,120分:23.0±1.6%,S.epidermidis刺激で60分:25.8±2.6%,90分:23.0±6.7%,120分:25.4±2.1%.F.n刺激で60分:39.3±3.9%,90分:20.4±9.7%,120分:25.4±5.3%,A.actinomycetemcomitans(A.a)刺激で60分:25.5±1.7%,90分:10.4±3.7%,120分:10.7±1.5%であり,A.aでマクロファージ内活性酸素産生が低い傾向が示された。bis(carboxyetyl)carboxyfluorescein(BCECF-AM)による細胞内PHの検討:マクロファージ食菌後60分における細胞pHをフローサイトメトリーにて検索した結果,コントロールpH7.2出250±27(平均蛍光強度)に対しP.gingivalis:206,S.epidermidis:181,F.n:155,A.a:149とP.gingivalisでは細胞内酸性化の傾向が低い傾向が認められた。

通过研究人类巨噬细胞培养系统中使用活细胞标记的荧光染料PKH-2，DCFH-DC和BCECF-AM的人类巨噬细胞培养系统中的牙龈疟原虫（人类牙周疾病中的主要病原体）的动力学获得以下发现。 （1）对PKH-2标记的细胞进行基于时间的检查：将人类巨噬细胞添加到PKH-2标记的孢子细胞中，随着时间的流逝，用抗巨噬细胞抗体单克隆抗体LEU-M3和抗填充的受体单克隆CR3抗体染色。流式细胞仪分析的结果表明，LEU-3M+和PKH-2+细胞速率为4小时：61.2±15.5％，24小时：30.7±10.2％，96小时：68.7±11.5％，在24小时内降低，在96小时时降低了4小时。这一发现与96小时培养后在细胞中证实细菌细胞的存在的发现是一致的。另一方面，CR3+细胞速率为63.5±7.0％，24小时：40.7％±12.0，96小时：24.3±10.5％，CR3表达下降。 （2）检查培养上清液中无产能的能力：根据Griesse的方法测量（1）中实验培养上清液中的无根本产生。结果表明，牙龈疟原虫为6-12小时：不可检测，24小时：0.05±0.02MUM，48小时：0.03±0.02MUM，72小时，72小时：0.05±0.03MUM，96小时，96小时：不可检测，并且表现出持续的低值，与72小时相比：0.2mum Cultans fl F. nuteatemum（F.Numum）。 （3）检查二氯氟甲苯甲酸酯（DCFH-DA）的活性氧：通过使用DCFH-DC通过流式细胞术分析获得了在巨噬细胞中产生活性氧的能力。活性氧生产细胞速率的结果为60分钟：22.0±5.6％的牙龈疟原虫刺激，120分钟，15.7±6％：23.0±1.6％，表皮刺激链球菌刺激，60分钟：25.8±刺激。 2.6％，90分钟：23.0±6.7％，120分钟：25.4±2.1％。 F.n stimulation was 60 min: 39.3 ± 3.9%, 90 min: 20.4 ± 9.7%, 120 min: 25.4 ± 5.3%, A. actinomycetemcomitans (A.a) stimulation was 60 min: 25.5 ± 1.7%, 90 min: 10.4 ± 3.7%, 120 min: 10.7 ± 1.5%, and A.a showed a low tendency for active oxygen production in macrophages.通过双BI（羧基）羧氟菌素（BCECF-AM）检查细胞内pH值：在巨噬细胞吞噬学后60分钟对细胞pH搜索的流式细胞仪搜索巨噬细胞吞噬学后的细胞pH值，显示对照7.2 7.2 pH 7.2 250±27（平均荧光强度）（平均荧光强度）降低了较低的趋势，显示了较低的细胞内酸的趋势：p. gingivalis：206，S. fleival issicis：20 6，fl.nivalis s。 A.A：149和P.牙龈。