架橋混成ヘモグロビンを用いたアロステリック効果の研究

使用交联混合血红蛋白的变构效应研究

• 批准号: 05780484
• 负责人: 柴山 修哉
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780484/
• 关键词: ヘモグロビン; アロステリック効果; 酸素平衝曲線; X線結晶解析

1.アロステリックタンパク質共通の分子論的機序を調べる目的で、ヘモグロビン分子の酸素結合における中間状態分子のモデル系をニッケルボルフィリン(デオキシヘムのモデル)による金属置換と分子内架橋(2量体組換え反応の防止)の合併による架橋金属置換混成ヘモグロビンで構築した。今年度行った研究では、全部で8種類ある中間状態分子のうち、研究の重要性が高いと思われる酸素分子の2個結合した4種類の中間状態分子に着目し、これら4分子のモデルとなる高純度試料の調整を行った。2.これらモデルを使った2段階酵素平衝曲線の測定から以下の結果を得た。(1)デオキシヘモグロビンではalphaサブユニットがbetaサブユニットと比較して約3倍高い酵素親和性を示す。(2)酵素化初期段階でのヘム間相互作用の大きさはbeta1beta2、alpha1beta1、alpha1beta2、alpha1alpha2の順に大きくなる。(3)これらのヘム間相互作用はタンパク質の高次構造変化を介して伝わったものと考えてもそれほど大きな矛盾は出てこない。3.本研究の主要な計画の1つに入っていた中間状態分子の高分解能X線結晶解析は予定していたよりも難しい実験であることが解ってきた。顕微分光器によるヘモグロビン結晶の酸素平衝曲線測定で結晶格子力の影響を調べたところ、酸素親和性の高い異常ヘモグロビンを含むほとんどのヒトヘモグロビンは、結晶中でダオキシヘモグロビン型の酸素親和性の低い構造に閉じこめられてしまうことが解った。したがって、中間状態を溶液に近い状態で結晶中に固定することは極めて難しいと思われる。現時点では先ず、結晶格子力のもとになる分子間水素結合に関与するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した異常ヘモグロビンを大腸菌で合成させ、結晶格子力を減少させたヘモグロビン結晶を作る方向で実験を進めている。

1. 为了研究变构蛋白共有的分子机制，我们通过用镍沃尔菲林（脱氧血红素的模型）进行金属取代和分子内交联（二聚体重组），使用血红蛋白分子氧键中的中间态分子模型系统(预防)用交联金属取代的杂化血红蛋白构建。在今年的研究中，我们重点关注了总共八种中间态分子中被认为具有很高研究重要性的、由两个氧分子键合而成的四种中间态分子，并创建了制备了这四种分子的模型。 2.使用这些模型测量两阶段酶平衡曲线，得到以下结果。 (1) 在脱氧血红蛋白中，α 亚基的酶亲和力大约是 β 亚基的三倍。 (2)酶化初期血红素-血红素相互作用的大小按照β1β2、α1β1、α1β2、α1α2的顺序增加。 （3）即使我们认为这些血红素-血红素相互作用是通过蛋白质构象的变化来传递的，也不存在显着的矛盾。 3.中间态分子的高分辨率X射线晶体分析是本研究的主要计划之一，结果证明这是一个比原计划更困难的实验。当我们通过显微光谱仪测量血红蛋白晶体的氧平衡曲线来研究晶格力的影响时，我们发现大多数人类血红蛋白，包括具有高氧亲和力的异常血红蛋白，在晶体I中都是氧亲和力类型。意识到我被困在一个低层结构中。因此，将晶体中的中间态固定为接近溶液的状态似乎极其困难。目前，第一步是利用大肠杆菌合成异常血红蛋白，其中参与分子间氢键的氨基酸残基（晶格力的来源）被其他氨基酸取代，从而产生晶体还原的血红蛋白晶体。晶格力的实验正在进行中。