タイマータンパク質EA4の計時機構解明を目指した研究

旨在阐明定时器蛋白EA4计时机制的研究

• 批准号: 20657031
• 负责人: 柴山 修哉
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20657031/
• 关键词: 生物時計; タイマータンパク質; X線結晶構造解析; 休眠打破

1. 初期状態EA4のX線結晶構造解析EA4はカイコ休眠卵の休眠打破に必要な冬期低温持続時間(5℃で約2週間)を計る機能を持つタイマータンパク質であり、室温の休眠卵中では時間読み停止機能を持つ38残基ペプチド(PIN)との複合体を形成することで時間読み開始前の初期状態に凍結されると報告されている。このような情報をもとに、カイコサナギ個体を宿主としたEA4とPINの共発現系を構築し結晶化スクリーニングを集中的に行った。しかし、複合体の構造解析にはまだ成功していない。これには理由がある。先ず、カイコ個体中ではPINが酵素分解を受け雑多な部分配列ペプチド集合体となり試料を複雑にしていること。また、試料中にPIN以外の未知のEA4結合性ペプチドが混在し、EA4・PIN複合体の形成効率を低下させていることである。本年度は、粗精製した共発現試料に対して大腸菌発現で作製したPINを大過剰に加え、25℃での限外濾過(分画分子量1万)を繰り返すことにより雑ペプチドを除去する方法を新たに取り入れた。ごく最近、この方法で精製した試料の微小結晶を得ることに成功した。現在、X線回折実験に適した大型単結晶の作製条件を検討している。また本年度は、上述の未知のEA4結合性ペプチドの全48アミノ酸配列を決定した。2. 計時現象の計算機シミュレーションEA4の時間読みは、低温刺激によりPINが解離することで始まり、10日以上の遅延相の後に一過性の鋭いATPase活性を発現することで終了する。この計時現象を説明する最も有力なモデルは、EA4分子内の銅イオンが配位子交換反応を経ながら活性中心までゆっくり移動し活性型に転移する「多段階逐次モデル」である。本年度は、このモデルの妥当性を計算機シミュレーションで検討した。その結果、実際のデータを再現するためには60以上の異なる段階を仮定する必要があることが分かった。これはかなり無理のある状態数であり、モデルの修正を検討中である。

1.初始状态EA4的X射线晶体结构分析 EA4是一种计时器蛋白，具有测量打破休眠蚕卵所需的冬季低温持续时间（5℃下约2周）的功能。具有38个残基的肽（PIN）的复合物，具有停止时间读取的功能，在时间读取开始之前被冻结到初始状态。基于这些信息，我们以蚕蛹为宿主构建了EA4和PIN的共表达系统，并进行了深入的结晶筛选。然而，对该复合体的结构分析尚未成功。这是有原因的。首先，在蚕个体中，PIN经过酶促降解，成为杂项部分序列肽的集合，使样品变得复杂。此外，样品中还存在除 PIN 之外的未知 EA4 结合肽，降低了 EA4-PIN 复合物形成的效率。今年，我们开发了一种去除杂肽的新方法，将大量大肠杆菌表达产生的 PIN 添加到粗纯化的共表达样品中，并在 25°C 下重复超滤（截留分子量：10,000）。进入。最近，我们成功获得了使用这种方法纯化的样品的微晶。我们目前正在研究生产适合 X 射线衍射实验的大单晶的条件。此外，今年我们还确定了上述未知 EA4 结合肽的完整 48 个氨基酸序列。 2.计算机模拟报时现象 EA4中的时间读数从PIN因冷刺激解离开始，在10多天的延迟阶段后以短暂的尖锐ATP酶活性表达结束。最有可能解释这种计时现象的模型是“多步顺序模型”，其中 EA4 分子内的铜离子通过配体交换反应缓慢移动到活性中心并转化为活性形式。今年，我们使用计算机模拟检验了该模型的有效性。他们发现需要假设 60 多个不同的阶段才能重现实际数据。这是一个相当不合理的状态数量，我们目前正在考虑修改模型。