タイマータンパク質EA4の計時機構解明を目指した研究

旨在阐明定时器蛋白EA4计时机制的研究

• 批准号: 20657031
• 负责人: 柴山 修哉
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20657031/
• 关键词: 生物時計; タイマータンパク質; X線結晶構造解析; 休眠打破

1. 初期状態EA4のX線結晶構造解析EA4はカイコ休眠卵の休眠打破に必要な冬期低温持続時間(5℃で約2週間)を計る機能を持つタイマータンパク質であり、室温の休眠卵中では時間読み停止機能を持つ38残基ペプチド(PIN)との複合体を形成することで時間読み開始前の初期状態に凍結されると報告されている。このような情報をもとに、カイコサナギ個体を宿主としたEA4とPINの共発現系を構築し結晶化スクリーニングを集中的に行った。しかし、複合体の構造解析にはまだ成功していない。これには理由がある。先ず、カイコ個体中ではPINが酵素分解を受け雑多な部分配列ペプチド集合体となり試料を複雑にしていること。また、試料中にPIN以外の未知のEA4結合性ペプチドが混在し、EA4・PIN複合体の形成効率を低下させていることである。本年度は、粗精製した共発現試料に対して大腸菌発現で作製したPINを大過剰に加え、25℃での限外濾過(分画分子量1万)を繰り返すことにより雑ペプチドを除去する方法を新たに取り入れた。ごく最近、この方法で精製した試料の微小結晶を得ることに成功した。現在、X線回折実験に適した大型単結晶の作製条件を検討している。また本年度は、上述の未知のEA4結合性ペプチドの全48アミノ酸配列を決定した。2. 計時現象の計算機シミュレーションEA4の時間読みは、低温刺激によりPINが解離することで始まり、10日以上の遅延相の後に一過性の鋭いATPase活性を発現することで終了する。この計時現象を説明する最も有力なモデルは、EA4分子内の銅イオンが配位子交換反応を経ながら活性中心までゆっくり移動し活性型に転移する「多段階逐次モデル」である。本年度は、このモデルの妥当性を計算機シミュレーションで検討した。その結果、実際のデータを再現するためには60以上の異なる段階を仮定する必要があることが分かった。これはかなり無理のある状態数であり、モデルの修正を検討中である。

1. X-ray crystal structure analysis of initial state EA4 EA4 is a timer protein that has the function of measuring the low temperature duration (approximately 2 weeks at 5°C) required to break down dormancy in dormancy in silkworm eggs, and is reported to be frozen to the initial state before the start of time reading by forming a complex with a 38-residue peptide (PIN) that has a time reading stop function in dormancy eggs at room temperature.基于此信息，构建了EA4和PIN的共表达系统，并以单独的蚕pa宿主为宿主进行了构建，并进行了结晶筛选。但是，对复合物的结构分析尚未成功。这是有原因的。首先，单个蚕的引脚会经历酶促降解，从而导致部分测序的肽组装使样品复杂化。此外，样品中混合了销钉以外的未知EA4结合肽，从而降低了EA4-PIN复合物的形成效率。今年，我们采用了一种新的方法来消除其他大肠杆菌表达产生的大量销钉，并在25°C下重复超滤（分子量为10,000）。最近，我们使用此方法成功地从纯化的样品中获得了微晶。当前，我们正在考虑适合X射线衍射实验的大型单晶的制备条件。此外，在今年，确定了上述未知EA4结合肽的总48个氨基酸序列。 2。计算机对计时现象的仿真ea4的时间读取始于由于冷刺激而导致销的解离，并以超过10天以上的延迟相后的瞬时，敏锐的ATPase活性的表达结束。解释该计时现象的最可能的模型是“多阶段顺序模型”，在该模型中，EA4分子中的铜离子在经历配体交换反应并转移到活动形式的同时缓慢移动到活性中心。今年，使用计算机模拟检查了该模型的有效性。结果表明，为了重现实际数据，有必要假设超过60个不同的阶段。这是一个相当不合理的状态，我们目前正在考虑修改模型。