酵母mRNAキャッピング酵素の機能部位に関する研究

酵母mRNA加帽酶功能位点的研究

基本信息

批准号：
05780465
负责人：
柴垣芳夫
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、酵母キャッピング酵素alphaサブユニットの構造と機能を、遺伝子工学の手法を用いて明らかにすることを目的として研究し、以下の結果を得た。1. alphaサブユニットは「酵素-GMP」反応中間体(E-pG)を経由する2段階でキャッピング反応を触媒するが、E-pGにおけるGMP結合部位Lys-70の役割を調べるため、Lys-70をsite-directed mutagenesis法を用いて、HisおよびIleに置換した変異体を作成した。これを大腸菌を用いて発現させ、E-pG形成活性を調べた結果、His,Ileいずれの置換体もE-pG形成はみられなかった。この結果は、70番アミノ酸がLysであることの重要性を示している。2. alphaサブユニットの構造遺伝子CEGlに、HindIIIリンカーを用いてアミノ酸挿入を行い、大腸菌を用いて変異alphaサブユニットを発現させ、E-pG形成活性を調べた。その結果、10種類の変異体のうち、GMP結合部位近傍に挿入を行ったHinP184、alphaサブユニットの中央ややN末よりに挿入を行ったXba502、Dra534、C末端近くに挿入を行ったXho1189の4種類については活性は検出されなかった。従って、E-pG形成活性には少なくともこれら3つの領域が必要であることが示唆された。3. CEGlは、酵母の生育にとって必須の遺伝子であり、CEGlを破壊した細胞株(cegl)は生育することが出来ない。そこで、リンカー挿入変異体をcegl株にプラスミドとして導入し発現させ、変異タンパク質の発現に依存した生育が観察されるかどうか見ることによって、変異タンパク質が酵母内で機能するかどうか検討した。その結果、in viteoにおいてE-pG形成が見られた変異体は、すべて生育したが、E-pG形成の見られなかった4種類については生育しなかった。このことは、E-pG形成とalphaサブユニットの機能との間に強い相関関係があることを示すものである。

今年，我们使用基因工程方法研究了酵母上限酶亚基的结构和功能，并获得了以下结果。 1。α亚基通过“酶-GMP”反应中间体（E-PG）将上限反应分为两个步骤，但为了研究GMP结合位点Lys-70在E-PG中的作用，使用Lys-70的位置诱变方法创建了ELE和ILE在E-PG中取代的突变体。使用大肠杆菌表达了这一点，并检查了E-PG形成活性，并且在其或ILE取代中都没有观察到E-PG的形成。该结果表明，使用Hindiii连接器在Alpha亚基的结构基因CEGL中进行了Lys对氨基酸70。2。氨基酸插入的重要性，使用大肠杆菌表达突变的α亚基，并检查了E-PGG构成活性。结果，未检测到10个突变体中的四个活性：HINP184，该HINP184在GMP结合位点附近XBA502，DRA534插入，插入了Alpha subunit的N末端和Xho1189的N末端，并插入了C-termerinus附近。因此，有人提出至少这三个区域是E-PG形成活性所必需的。 3。CEGL是酵母生长的必不可少的基因，破坏CEGL（CEGL）的细胞系无法生长。因此，我们通过将连接器插入突变体作为质粒引入CEGL菌株并表达其表达的静音蛋白是否在酵母中起作用，并检查是否观察到了依赖于静音蛋白表达的生长。结果，所有在Viteo中表现出E-PG形成的突变体都会增长，但是未显示E-PG形成的四个物种并未生长。这表明E-PG形成与α亚基函数之间存在很强的相关性。