テロメラーゼ構成遺伝子群の同定及び精製

端粒酶组成基因的鉴定和纯化

基本信息

批准号：
05780434
负责人：
今井剛
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780434/
关键词：
テロメラーゼテロメア DNA固定化アフィニティラテックス粒子

项目摘要

テロメラーゼ構成遺伝子群の精製を行なうにあたり、実験材科としてヒトの細胞株であるHeLa細胞を用いた。HeLa細胞よりDignamらの方法を用いて粗核抽出液及び粗細胞質抽出液を作製し、テロメアDNA配列をもつ合成オリゴヌクレオチド及び基質を反応させた。その結果、全テロメアDNA伸長活性(テロメラーゼ活性)のうち約80%が粗細胞質抽出液中に検出された。そのため、粗細胞質抽出液を精製出発材料としてテロメラーゼ構成遺伝子群の精製及び単離を行なっている。しかし、テロメラーゼ構成遺伝子群は、RNAと複数のタンパク質の複合体であると推測されており、精製が困難であると考えられた。そのため、精製方法は、高効率で迅速に行なえるものでなければならない。そこで、当研究室で開発されたDNA固定化アフィニティラテックス粒子を用いてHeLa細胞粗細胞質抽出液よりテロメラーゼ構成遺伝子群の精製を試みた。しかし、テロメラーゼ構成遺伝子群が失活してしまい精製が行なえなかった。また、テロメラーゼ構成遺伝子群の特性ついても解析を行なっている。その結果、熱(60度5分間)、硫酸アンモニウム沈殿、proteinase及びRNaseに感受性があることか判明した。即ち、テロメラーゼ構成遺伝子群は、タンパク質及びRNAを含むことが明かとなった。現在、以下の三点を中心に研究を行なっている。第一に新たなDNA固定化アフィニティラテックス粒子の作製である。第二に、粗細胞質抽出液とDNA固定化アフィニティラテックス粒子の結合反応の条件設定の変更である。第三に出発材料の粗細胞質抽出液を他のカラムクロマトグラフィーで一度分画してからDNA固定化アフィニティラテックス粒子による精製に用いる。

在纯化端粒酶 - 固定基因组的纯化中，HeLa细胞（人类细胞系）被用作实验材料。使用Dignam等人的方法从HeLa细胞中制备了粗核提取物和粗核提取物，并反应了携带端粒DNA序列的合成寡核苷酸和底物。结果，在粗细的细胞质提取物中检测到总端粒DNA扩展活性（端粒酶活性）的约80％。因此，粗细的细胞质提取物被用作纯化和分离端粒酶 - 固定基因组的起始物质。然而，据信端粒酶 - 固定基因组是RNA和多种蛋白质的复合物，并且纯化很困难。因此，纯化方法必须高效且快速。因此，我们试图使用在我们实验室中开发的DNA-毫米化亲和乳胶颗粒从HeLa细胞的粗细细胞细胞的端粒酶 - 固定基因组纯化。但是，端粒酶 - 抑制基因组被停用，并且不可能进行纯化。此外，还分析了端粒酶 - 抑制基因组的特征。结果表明，硫酸铵沉淀，蛋白酶和RNase对热量（60°C）敏感。也就是说，据揭示了端粒酶 - 抑制基因组含有蛋白质和RNA。目前，我们正在进行研究以下三个点的研究：首先，它是新的DNA毫米化亲和力乳胶颗粒的生产。其次，更改了粗细细胞质提取物和DNA毫米化亲和乳胶颗粒之间结合反应的条件设置。第三，起始材料的粗细细胞质提取物被另一列色谱法分离一次，然后用DNA-毫米化的亲和力乳胶颗粒纯化。