P.gingivalis 40-kDa外膜タンパク質の生理的機能

牙龈卟啉单胞菌40-kDa外膜蛋白的生理功能

基本信息

批准号：
05771566
负责人：
平塚浩一
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は既に、Porphyromonas(以前はBacteroides)gingivalis株に特異的である40-kDa外膜タンパク質(40k-OMP)をコードする2.0kb EcoRI遺伝子断片(40k-OMP gene)のクローニングおよび全塩基配列の解読に成功している。この40k-OMP geneを、大腸菌とBacteroides種とのshuttle vectorであるpVAL-1のEcoRIサイトに挿入し、これをpMD170と命名した。pMD170を遺伝子導入装置SSH-10(島津)を使用し、エレクトロポレーション法により、大腸菌HB101内に導入し、Amp・Tcプレートにてコロニーを選択した。このコロニーが、リコンビナント40k-OMPを産生することは、抗40k-OMP抗体を使用し、Western-blotting法により確認した。次に、40k-OMP geneの欠損株を作成するために、pMD170に挿入されている40k-OMP gene中のopen reading frame(499-1540 bp)において、切断サイトを1カ所のみ持つ制限酵素の中からBalIを選択し、これによってpMD170を切断し、切断部位にクロラムフェニコール遺伝子を挿入することにより変異株の作成をこころみた。クロラムフェニコール遺伝子はpUC type vectorであるプラスミドpHSG396(宝酒造)をSau96Iで切断し、平滑末端化することにより得た。また、P.gingivalis381へのshuttle vector pMD170の移行は大腸菌との接合による方法は、Dyerらの方法(B.B.R.C.,182,1012,1992)に従い行い、またエレクトロポレーション法はYoshimotoらの方法(O.M.I.,8,208,1993)を参考にして、両方法により、pMD170の移行を試た。移行の効率はEmとKmを添加したBHI血液寒天培地上にて発育するP.gingivalisコロニーの数で確認した。現在のところ、エレクトロポレーション法において電界強度は12kV/cm、パルス幅1msec、パルス回数2回の条件でP.gingivalisコロニーの発現を確認したが、その効率は低く、改良を試みている。

我们已经成功克隆并完全测序了编码牙龈卟啉单胞菌（以前称为拟杆菌）菌株的 40-kDa 外膜蛋白（40k-OMP）的 2.0kb EcoRI 基因片段（40k-OMP 基因）。该 40k-OMP 基因被插入 pVAL-1（大肠杆菌和拟杆菌属物种的穿梭载体）的 EcoRI 位点，并命名为 pMD170。使用基因转移装置SSH-10(Shimadzu)通过电穿孔将pMD170导入大肠杆菌HB101，并在Amp/Tc平板上选择菌落。使用抗40k-OMP抗体通过Western印迹证实该集落产生重组40k-OMP。接下来，为了创建 40k-OMP 基因缺失菌株，我们在插入 pMD170 的 40k-OMP 基因的开放阅读框（499-1540 bp）中插入了只有一个切割位点的限制性内切酶，我们从 ,用它切割pMD170，并试图通过将氯霉素基因插入切割位点来创建突变株。氯霉素基因是通过用Sau96I切割作为pUC型载体的质粒pHSG396(Takara Shuzo)并使其平端化而获得的。根据 Dyer 等人的方法 (B.B.R.C., 182, 1012, 1992)，并根据 Yoshimoto 等人的方法通过电穿孔将穿梭载体 pMD170 转移至 P. gingivalis381。，1993），我们尝试使用这两种方法转移 pMD170。通过在补充有 Em 和 Km 的 BHI 血琼脂培养基上生长的牙龈卟啉单胞菌菌落数量来证实转移效率。目前我们已经用电穿孔法在电场强度12 kV/cm、脉冲宽度1 msec、脉冲次数2次的条件下证实了牙龈卟啉单胞菌菌落的表达，但效率较低，我们无法确定牙龈卟啉单胞菌菌落的表达情况。正在努力改进它。