ストレプトコッカスミュータンス酸ストレス蛋白質の遺伝子クローニング

变形链球菌酸性应激蛋白基因克隆

基本信息

批准号：
09771521
负责人：
平塚浩一
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

S.mutans GS5をglucose存在下のTYNa培地(pH7.5)中でmid-log phaseまで嫌気培養し、ペレットを回収後、pH7.5およびpH5.5の同培地中に懸濁し、3時間嫌気下にてインキュベートした。破壊が容易でない本菌体からの全RNAの精製はTRIzolとFastPrep Machineの併用にて行ない、質の高いものが短時間で精製可能となった。mRNAの3'末端にpoly(A)を持たない原核生物からの1st.stranded cDNA合成はRandom primer(N)6を用いてSuperscript IIで合成を行った。原核細胞のサブトラクション法を成功させるためには、いかにしてrRNAを取り除くかが鍵となる。S.mutansの16S-23S rRNA断片の増幅する際には、本菌体から精製した染色体DNAを鋳型に、リバースプライマーは5'末端をビオチン(BT)ラベルしたものを用いてPCR増幅した。PCR産物はストレプトアビジン磁気ビーズ(ST-B)に結合させ、NaOHにて相補的な断片は除去した。差分化は、酸性下の1st.stranded cDNA合成物、BT標識した中性下の全RNAおよびST-B結合の一本鎖16S-23S rRNA断片の3種を混合し行い、まずST-Bに結合させた後、マグネットにて除去されなかったものを次の試料として用いた。以降は、これに同様の中性下全RNAおよびrRNA断片を加えて計3回行った。精製後、2nd.stranded cDNA合成を行い、限界濾過カラムにて、分子量の小さいものと合わせてtRNA由来のものを除去した。末端を揃えた後、ZeroBlant PCR Cloning Kitを用いてクローニングした。現在、スクリーニングを行い、塩基配列を決定している。

S.mutans GS5在存在葡萄糖的情况下在TYNa培养基(pH 7.5)中厌氧培养至对数中期，收集沉淀后，将其悬浮在pH 7.5和pH 5.5的相同培养基中，并厌氧培养底部孵育3小时。使用TRIzol和FastPrep Machine的组合从这种难以破坏的细菌细胞中纯化总RNA，从而可以在短时间内纯化高质量的RNA。使用 Superscript II 使用随机引物 (N)6 从 mRNA 3' 末端不具有聚 (A) 的原核生物合成第一链 cDNA。原核细胞成功消减的关键是如何去除rRNA。扩增变形链球菌的16S-23S rRNA片段时，以从该菌体纯化的染色体DNA为模板，使用5'末端标记有生物素(BT)的反向引物进行PCR扩增。 PCR 产物与链霉亲和素磁珠 (ST-B) 结合，并用 NaOH 去除互补片段。将酸性条件下的三种第一链cDNA复合体、中性条件下的BT标记的总RNA、以及与ST-B结合的单链16S-23S rRNA片段混合，进行差异分化，将未除去的那些结合起来。通过磁铁被用作下一个样品。此后，在相同的中性条件下加入总RNA和rRNA片段，总共重复实验3次。纯化后，合成第二链cDNA，并使用超滤柱除去源自tRNA的成分以及低分子量成分。对齐末端后，使用 ZeroBlant PCR 克隆试剂盒进行克隆。目前正在进行筛选，碱基序列已确定。