基質小胞の生化学的単離法に対する再検討

基质囊泡生化分离方法综述

基本信息

批准号：
05771523
负责人：
細川隆司
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyushu Dental College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771523/
关键词：
基質小胞マイクロソーム遠心分画法

项目摘要

Hosokawa(1988)らにより基質小胞中にlactate dehydrogenase(LDH)が存在することが明らかにされて以来、我々は、従来の指標酵素であるalkaline phosphatase(ALP)と共に、LDHを利用して基質小胞画分を詳細に検討してきた。この結果、(1)この画分には、ALPを含まずLDHを含む性質の異なった小胞が混在しており、この小胞は、電顕的にALPを含む小胞とは電子密度が異なっていること(2)この画分には明らかに細胞のミクロソームが混入していることが電顕的に認められることなどの事実が明らかになってきた。もしも、この画分の純度が低く基質小胞が生化学的に単一でない物だとすれば、現在まで得られた多くの研究成果は、水泡に帰してしまう。そこで、この基質小胞の単離法について再検討を行ない基質小胞画分の純度の再検討を行なってきた。以下はその概要である。1.ミクロソームATPaseと形質膜のATPaseのそれぞれの特異抗体を用いた基質小胞画分の純度の検定基質小胞画分には、細胞のミクロソームがかなり混入していると思われる。そこで、形質膜由来と考えられる基質小胞のATPaseとミクロソームのATPaseが分子種が異なることを利用してそれぞれの特異抗体を用いてイムノタイトレーションや免疫組織化学的方法によりどの程度ミクロソームが混入しているかを調べた。その結果、使用した抗体の特異性に問題があり、確証的な結論は、得られていないが、ミクロソームの混入を多く認めるようなデータが得られつつある。2.ALPとLDHのイソ酵素に対する抗体を用いた基質小胞画分に対する免疫組織化学的検索基質小胞画分の中に、ALPを含まずLDHのみを含む小胞があることが明らかになってきたことから、両酵素の抗体を用いて免疫組織化学的方法によりどの程度LDHのみを含む小胞が混入しているかを調べた。結果としてLDHのバックグラウンドレベルが高く、免疫電顕のプロトコルを再検討中である。

自Hosokawa（1988）等。揭示了在底物囊泡中存在鞋底脱氢酶（LDH），我们已经使用LDH详细检查了底物囊泡分数，以及常规的指示剂酶碱性磷酸酶（ALP）。结果，很明显，（1）该馏分包含具有不同特性的囊泡，这些特性不包含ALP并包含LDH，并且这些囊泡的电子密度不同于电子显微镜中包含ALP的囊泡（2），显然，该馏分被细胞显微体污染。如果此部分的纯度低，并且底物囊泡在生化上是非单个的，那么迄今为止获得的许多研究结果都归因于水泡。因此，已经重新检查了隔离底物囊泡的方法，并重新检查了底物囊泡馏分的纯度。以下是对此的概述。 1。使用特异性抗体对微粒体ATPase和质膜ATPase评估底物囊泡馏分的纯度，认为底物囊泡馏分被细胞微粒体显着污染。因此，我们在底物囊泡中使用了不同的ATP酶的分子物种，这些囊泡被认为是从质膜和微粒体中的ATPases得出的，并检查了使用每种特定抗体使用免疫抑制和免疫组织化学方法污染微粒体的程度。结果，所使用的抗体的特异性存在问题，尽管尚未获得确认的结论，但数据表明正在获得大量的微型污染。 2。对使用ALP和LDH抗体的底物囊泡的免疫组织化学搜索，很明显，在底物囊泡馏分中，只有一个没有ALP的LDH的囊泡，因此我们研究了仅使用两种enzemes的抗体污染了仅污染LDH的囊泡的程度。结果，LDH的背景水平很高，目前正在审查免疫电子显微镜方案。