イネ2本鎖RNAの複製機構の解析及びその植物RNAベクターへの応用

水稻双链RNA复制机制分析及其在植物RNA载体中的应用

基本信息

批准号：
09740592
负责人：
福原敏行
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

イネ2本鎖RNAの複数機構を研究するため、イネ懸濁培養細胞よりマイクロソーム画分を調整し、2本鎖RNAの複製酵素活性を[α-32P]UTPの取り込み活性を指標に解析した結果、2本鎖RNAを保持する細胞のマイクロソーム画分には特異的な取り込み活性が検出された。この反応産物を電気泳動により同定した結果、イネ二本鎖RNAの分子量と同じ約14kbの位置に優先的な取り込み産物が観察され、経時的にその取り込みが増加した。ノーザンハイブリダイゼーション解析より、この反応産物は、イネ2本鎖RNA中にコードされているRNA依存RNA合成酵素(RdRp)による複製産物である事が示された。このRdRp活性は、マグネシウムおよびヌクレオチド三リン酸要求性であり、アクチノマイシンDやαアマニチンといったDNA依存RNA合成酵素の阻害剤に非感受性であった。Protease Kとデオキシコール酸を用いた実験からは2本鎖RNAの複製複合体が、ベクシル状の膜に包まれている事が示唆された。また細胞内でプラス鎖同士がランダムに繋がった分子が存在していることが明らかとなった。この分子はin vitroの複製反応において急激に増加したことから、イネ内在性2本鎖RNAの複製反応に関与する中間産物であると推測された。界面活性剤によるマイクロソーム画分からのRdRpの可溶化と、グリセロール密度勾配分画を行うことによりさらにRdRpを精製し、外から加えたRNAを鋳型としてin vitro複製反応を行った。その結果、精製した2本鎖RNAが複製に必須な因子との結合能を持つものの、複製に対しては不活性であり、複製活性を持つのは一本鎖のRNA分子であることが示唆された。さらに、マイナス鎖の3'末端、約410bの配列中にプラス鎖合成の際の複製必須領域が含まれている事が示唆された。以上、本年度は、RdRpの諸性質や複製必須流域が明らかとなるなど、イネ2本鎖RNAの植物RNAベクター応用にむけ十分な成果が得られた。

为了研究水稻双链RNA的多种机制，我们从水稻悬浮培养细胞中制备了微粒体级分，并以[α-32P]UTP摄取活性为指标分析了双链RNA复制酶活性，结果获得了特异性。在保留双链 RNA 的细胞微粒体部分中检测到摄取活性。通过电泳鉴定该反应产物的结果，在与水稻双链RNA相同分子量的约14kb的位置观察到优先摄取产物，并且其摄取随着时间的推移而增加。 Northern杂交分析表明该反应产物是水稻双链RNA中编码的RNA依赖性RNA合成酶(RdRp)的复制产物。这种 RdRp 活性需要镁和三磷酸核苷酸，并且对 DNA 依赖性 RNA 合成酶抑制剂（例如放线菌素 D 和 α-鹅膏蕈碱）不敏感。使用蛋白酶 K 和脱氧胆酸的实验表明，双链 RNA 复制复合物被包裹在类似 vexyl 的膜中。人们还清楚地看到，细胞内存在着正链随机连接的分子。由于该分子在体外复制反应过程中迅速增加，推测其是参与水稻内源双链RNA复制反应的中间产物。通过用表面活性剂从微粒体级分中溶解RdRp并通过甘油密度梯度分级进一步纯化RdRp，并使用外部添加的RNA作为模板进行体外复制反应。结果表明，虽然纯化的双链RNA具有与复制必需的因子结合的能力，但它对于复制来说是无活性的，这表明它是具有复制活性的单链RNA分子。此外，有人认为负链3'端的大约410b序列包含正链合成过程中复制所必需的区域。如上所述，今年我们在将水稻双链RNA应用于植物RNA载体方面获得了足够的成果，例如阐明了RdRp的各种特性和复制的必需区域。