ミトコンドリア異常増殖腫瘍に関する分子遺伝子学的解析

线粒体异常生长肿瘤的分子遗传学分析

• 批准号: 05770103
• 负责人: 遠藤 仁司
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770103/
• 关键词: ミトコンドリア; 形質転換; 腺腫

現在、ミトコンドリア形成制御に関してのin vitroのモデル系は非常に少ない。本研究では電子顕微鏡的には細胞質内に充満するミトコンドリア像がこの腫瘍の特徴であるオンコサイトーマの初代培養系を確立しその分子生物学的特徴を明らかにし、更にはその病因遺伝子を同定することにより、ミトコンドリア形成制御の機構の一端を解明する端緒とすることを目的とした。先ず、Hurtle細胞陽性の甲状腺腫の一部を手術検体から得(倫理委員会許可済)、電子顕微鏡にてミトコンドリア様構造物の充満像を確かめた。本腫瘍組織からDNAを抽出し、ミトコンドリアDNAの増加の有無をサザンブロット法にて確かめた結果、コントロールとして用いた甲状腺機能亢進症や甲状腺腫のDNAに較べ2-5倍ミトコンドリアDNA量が増加していた。またチトロームCオキシダーゼの電子顕微鏡を用いた活性染色の結果、細胞質内のミトコンドリア様構造物はコントロールに較べ強く活性が認められた。その結果、本腫瘍では生理活性およびミトコンドリアDNAを有するミトコンドリアが細胞質内に増加していることを直接証明した(日本組織細胞化学会に発表)。次に、この検体から腫瘍細胞の初代培養を、グルコース添加培地、グルコース除去培地の二通りの培養条件下で試みた。その結果、継代を重ねるにつれ線維芽細胞の混入が激しく腫瘍細胞のクローン化は困難であった。また初代培養細胞に複製開始点欠失SV40DNAを遺伝子導入し細胞のクローン化を試み、約20個のクローンを得た。得られた細胞からDNAを抽出し、サザンブロット法にてミトコンドリアDNAの増加を検討した結果約20倍前後の変動しかなく、またロダミン123を用いてミトコンドリアの生染色を行いフローサイトメトリーにてミトコンドリアが増加しているか否かを検討した結果、コントロールとの間に有意の差は認められなかった。クローン化した細胞が上皮由来でなく繊維芽細胞由来である可能性や、また上皮由来であってもSV40DNAを導入したためにミトコンドリア異常増加の形質を落としてしまった可能性もあり現在検討中である。また培養条件によってもミトコンドリア量は影響を受ける可能性があり、今後の検討が必要である。

当前，用于调节线粒体形成的体外模型系统很少。在这项研究中，目的是建立肿瘤细胞瘤的主要培养系统，该肿瘤的特征是该肿瘤的特征，线粒体图像填充了细胞质，并阐明其分子生物学特征，并进一步识别其致病基因，从而阐明一种用于控制线粒体形成的机制。首先，从手术标本（允许伦理委员会允许）获得了一部分赫尔特细胞阳性甲状腺肿，并使用电子显微镜确认了线粒体样结构的填充图像。从肿瘤组织中提取DNA，并确认使用Southern印迹的线粒体DNA是否增加了线粒体DNA的增加，而与甲状腺功能亢进症的DNA相比，线粒体DNA的量增加了2-5倍，用作对照。此外，由于使用电子显微镜对滴滴氧化酶的活性染色，细胞质中的线粒体样结构比对照更活跃。结果，直接证明，该肿瘤的细胞质中具有生理活性和线粒体DNA的线粒体（在日本的组织锻炼学会中提出）。接下来，在两种不同的培养条件下尝试了该标本的肿瘤细胞的原发性培养：葡萄糖添加的培养基和葡萄糖抑制培养基。结果，成纤维细胞被越来越多的通道污染，因此难以克隆肿瘤细胞。此外，将原代培养的细胞用没有复制起源的SV40 DNA转染，并试图克隆细胞，从而产生约20个克隆。从获得的细胞中提取DNA，并使用Southern印迹检查线粒体DNA的增加，结果表明，只有20倍变化，线粒体被若丹不明123染色，流式细胞仪仪仪仪仪仪量表是否增加，并且在细胞和对照组之间是否没有明显的差异。目前正在研究它，因为克隆的细胞可能是从成纤维细胞而不是上皮来得出的，即使它们是上皮细胞，也可能引入了SV40 DNA，从而导致丧失了增加线粒体异常的特征。此外，线粒体水平可能会受到培养条件的影响，并且必须进行未来的研究。

项目成果

Matsuda,C.: "Tissue-specific isoforms of the bovine mitochondrial ATP synthase gamma-subunit." FEBS Lett.325. 281-284 (1993)

Matsuda,C.：“牛线粒体 ATP 合酶 γ 亚基的组织特异性亚型。”

遠藤仁司: "ミトコンドリアATP合成酵素の選択的スプライシングによる組織特異的アイソフォーム." 細胞工学. 12. 918-923 (1993)

Hitoshi Endo：“通过线粒体 ATP 合酶的选择性剪接实现组织特异性亚型。细胞工程”12.​​ 918-923 (1993)。

Endo,H.: "Exclusion of an alternatively spliced exon in ATP synthase gamma-subunit pre-mRNA requires de novo protein sythesis." J.Biol.Chem.269(in press). (1994)

Endo,H.：“排除 ATP 合酶 γ 亚基前 mRNA 中的选择性剪接外显子需要从头合成蛋白质。”

Matsuda,C.: "Comparison of ATP ase activities of bovine heart and liver mitochondrial ATP synthases with different tissue-specific gamma-subunit isoforms." Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1994)

Matsuda,C.：“牛心脏和肝脏线粒体 ATP 合酶与不同组织特异性 γ 亚基亚型的 ATP 酶活性比较。”

Matsuda,C.: "Human Mitochondrial ATP synthase gamma-subunit:gene struture and tissue-specific diversity caused by alternative RNA splicing." J.Biol.Chem.268. 24950-24958 (1993)

Matsuda,C.：“人类线粒体 ATP 合酶 γ 亚基：由选择性 RNA 剪接引起的基因结构和组织特异性多样性。”