機能性人工細胞の設計・製作と時間分解計測による解析

功能性人造细胞的设计和生产以及使用时间分辨测量的分析

• 批准号: 03305002
• 负责人: 川戸 佳
• 金额: $ 4.35万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Co-operative Research (A)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03305002/
• 关键词: 人工細胞; 時間分解計測; チトクロムP-450; ロドプシン; 顕微動画計測; タンパク質運動; Ca; レセプター; 機能性人工細胞; 電子スイッチング; ホルモン合成; 薬物代謝応答; 光応答; チトクロ-ム Pー450; 時間分解分光計測

昨年度成功した人工細胞を用いて生物物理的解析を行って注目すべき解析結果が得られた。(1)精製した副腎皮質のチトクロムP-450(scc)+還元酵素系と、精製したチトクロムP-450(c21,17α)+還元酵素系を、リン脂質再構成膜に組み込んだ、ホルモン合成人工細胞を用いて蛋白回転運動計測や時間分解スペクトル計測を行い次の事柄が明らかにされた:アドレノドキシン・P-450(scc)とアドレノドキシン・還元酵素の2種類の複合体が衝突して電子が伝達されること。P-450(c21)は還元酵素と会合体を作るが、P-450(17α)は還元酵素と会合体を作らない。(小南、原、石村、川戸、吉川)(2)薬物代謝を行う肝臓チトクロムP-450II BやP-450I Aの人工改変体を遺伝子発現で酵母などの細胞に組み込むことで、信号ペプチドの配列がP-450の膜挿入に果たす役割を解析した。またアミノ酸を点変異させて還元酵素とP-450の静電的に相互作用していることを明らかにした。P-450の計算機による一時構造解析で、多くのP-450の膜貫通領域は1箇所くらいしかなく、膜に一部分埋没している部分の重要性が指摘された。(清水、大村、美宅)(3)顕微動画計測では以下のことが明らかになった:膜レセプターや膜蛋白の運動は、裏打ちの細胞骨格で作られたパッチ構造の中で制限された運動をしている。ウニの卵細胞の授精に伴って、Caの移動→繊毛の方向パターン変化→細胞内pHの変動が連続して起こる。免疫物質の刺激により細胞外CaがB細胞の核内にまで移動することを発見した。(楠見、木下、中西)(4)脂質の種類が異なると、膜内のチトクロムc3の存在状態が単量体と二量体の違いがあり電子伝達機構が異なることを見いだした。(阿久津)(5)ロドプシンの光化学サイクルの各中間体で蛋白の内部アミノ酸の配置変化を時間分解計測で見いだした。(津田、神山)。

使用去年成功的人造细胞进行生物物理分析，并获得了显着的分析结果。 （1）使用激素合成的人工细胞测量蛋白质旋转运动和时间分解光谱法，该细胞结合了纯化的肾上腺皮层细胞色素P-450（SCC） +还原酶系统，并纯化的细胞色素P-450（C21,17α） +降低了磷酸化的磷酸到磷脂量重新磷脂，光谱：揭示了以下内容：两种类型的复合物，肾上腺素毒素，P-450（SCC）和肾上腺素毒素以及还原酶碰撞以传输电子。 P-450（C21）形成与还原酶的关联，但P-450（17α）不形成与还原酶的关联。 （Kominami，Hara，Ishimura，Kawado，Yoshikawa）（2）我们分析了信号肽序列在P-450膜插入p-450中的作用，将肝细胞色素P-450II B和P-450I A的人工变异纳入诸如YEAST YEAST YEAST的细胞中。还揭示了氨基酸被突变以揭示还原酶和P-450之间的静电相互作用。 P-450的基于计算机的临时结构分析表明，大多数P-450中只有一个跨膜区域，并且指出了埋在膜中的零件的重要性。 （Shimizu，Omura，Mitake）（3）显微镜视频测量结果揭示了以下内容：膜受体和膜蛋白的运动涉及由背部细胞骨架产生的斑块结构内受到限制运动。随着海胆细胞的授精，Ca的变化，纤毛方向模式的变化以及细胞内pH的变化是不断发生的。我们发现，细胞外Ca在刺激免疫物质后迁移到B细胞的核中。 （Kusumi，Kinoshita，Nakanishi）（4）我们发现，当脂质类型不同时，膜中的细胞色素C3的存在在单体和二聚体之间存在不同，并且电子传递机制也不同。 （Akutsu）（5）通过时间分辨测量结果发现，在光紫红蛋白的光化学周期中，每个中间体中蛋白质内氨基酸的排列变化。 （Tsuda，kamiyama）。

项目成果

Y.Ohta: "“Conversion of Cholesterol to Pregnenolone Mobilizes Cytochrome Pー450 in the Inner Membrane of Adrenocortical Mitochondria:Protein Rotation Study"" J.Biochem. 107. 97-104 (1990)

Y.Ohta：“胆固醇转化为孕烯醇酮动员肾上腺皮质线粒体内膜中的细胞色素 P-450：蛋白质旋转研究”J.Biochem. 107. 97-104 (1990)

Y.Ohta: "“Protein Rotation Study of Cytochrome Pー450 in Submitochondrial Particles:Effect of KCI and Intermolecular Interactions with Redox Partners"" J.Biochem. 109. 594-599 (1991)

Y.Ohta：“线粒体颗粒中细胞色素 P-450 的蛋白质旋转研究：KCI 的影响以及与氧化还原伙伴的分子间相互作用”，J.Biochem. 109. 594-599 (1991)

Y.Ohta: "Dynamic Structures of Adrenocortical Cytochrome P-450 in Proteoliposomes and Microsomes:Protein Rotation Study" Biochemistry. 31. 12680-12687 (1992)

Y.Ohta：“脂蛋白体和微粒体中肾上腺皮质细胞色素 P-450 的动态结构：蛋白质旋转研究”生物化学。

Y.Miura: "“Effects of Oxygen on the Relative Photodisso ciability of Cytochrome Pー450・CO Complex in Rat Liver Microsomes"" Biochemistry. 30. 3395-3400 (1991)

Y.Miura：“氧气对大鼠肝微粒体中细胞色素 P450·CO 复合物的相对光解离性的影响”，生物化学 30. 3395-3400 (1991)。

M.Ishigooka: "¨Role of Glu318 at the Putative Distal Site in the Catalytic Function of Cytochrome P450d¨," Biochemestry. 31. 1528-1531 (1992)

M.Ishigooka：“Glu318 在细胞色素 P450d 催化功能中的假定远端位点的作用”，《生物化学》31。1528-1531 (1992)。