捕捉化合物を用いた平滑筋細胞内カルシウム動員機構の薬理学的研究

使用清除化合物进行平滑肌细胞内钙动员机制的药理学研究

基本信息

批准号：
01570095
负责人：
飯野正光
金额：
$ 0.19万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至 1990
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は昨年度に購入したキセノンフラッシュランプを用いてcaged化合物の光分解の試験と、cagedイノシト-ル三燐酸(caged IP_3)によるモルモット門脈平滑筋スキンドファイバ-からのCa放出を測定した。内径400μmのガラス毛細管をキュベットとして用い、蛍光Ca指示薬fluoー3によってCa濃度を測定した。蛍光強度を測定する方向と直交する方向からキセノンフラッシュランプによる強力な紫外光を照射して、キュベット内のcaged化合物の光分解を行った。Caged Ca(DMーnitrophen)を用いた結果では、100Jのフラッシュで約50%の光分解効率が得られた。キュベット内に平滑筋スキンドファイバ-を固定し、1ないし30μMのcaged IP_3に浸とうした後にフラッシュを行うとt_<1/2>が1秒前後の時間経過でCa増加が起こる。このCa濃度増加は、前もってCa取り込み処理を行わないと見えないので、平滑筋CaストアからのCa放出によるものであることがわかる。またこのCa放出には、S字状の時間経過が見られる。すなわち光分解直後はCa放出速度が遅いが、数百ミリ秒経ちCa濃度が増加してくるとCa放出速度が増大してくる。しかし、初めから溶液に適当量のCaを加えて、フラッシュ前の遊離Ca濃度を300nM程度に増加させておくと、S字状の時間経過は観察されず概ね指数関数的なCa放出が観測される。更にCaを加えてフラッシュ前のCa濃度を500nM以上にしておくとCa放出速度はかえって減少する。この様な結果からIP_3によるCa放出はCa濃度に依存し、300nM付近に至適Ca濃度が存在することが分かる。低Ca濃度でフラッシュを行うと、放出されたCaによって更にCa放出が促進されるためS字状の時間経過が得られるものと考えられる。この様にIP_3によるCa放出にはCaを介する正帰還経路が存在し、見かけ上非常に急峻なIP_3の用量反応関係が得られる。このことはIP_3によるCa放出が細胞内の限局した部分で起こり得ることを示している。

今年，我们使用去年购买的氙闪光灯测试了笼状化合物的光分解，并使用笼状肌醇三磷酸（笼状IP_3）测量了豚鼠门静脉平滑肌去皮纤维的Ca释放量。使用内径为400μm的玻璃毛细管作为比色皿，使用荧光Ca指示剂fluo-3测量Ca浓度。通过从与荧光强度测定方向垂直的方向照射来自氙闪光灯的强紫外线，将比色杯内的笼状化合物光分解。在使用笼式钙（DM-硝基酚）的结果中，在 100J 闪光下获得了约 50% 的光解效率。当将平滑肌皮纤维固定在比色皿中并浸入1至30μM笼式IP_3中然后冲洗时，当t_<1/2>为约1秒时，Ca随时间推移而增加。这种Ca浓度的增加是不可见的，除非提前进行Ca摄取治疗，因此可以看出这种增加是由于平滑肌Ca储存中的Ca释放所致。此外，在该 Ca 释放中观察到 S 形时间进程。即，光解后立即Ca释放速率缓慢，但随着数百毫秒后Ca浓度增加，Ca释放速率增加。然而，如果从一开始就向溶液中添加适量的Ca，并将冲洗前的游离Ca浓度增加至约300nM，则不会观察到S形时间进程，并且观察到近似指数的Ca释放。另外，如果添加Ca使冲洗前的Ca浓度达到500nM以上，则Ca的释放速度实际上会降低。这些结果表明IP_3的Ca释放取决于Ca浓度，并且最佳Ca浓度存在于300nM左右。据认为，当在低Ca浓度下进行冲洗时，释放的Ca进一步促进Ca的释放，导致S形时间进程。这样，IP_3 的 Ca 释放存在 Ca 介导的正反馈途径，导致 IP_3 的剂量反应关系明显非常陡峭。这表明IP_3的Ca释放可能发生在细胞内的局部区域。