鉄酸化細菌の鉄酸化酵素遺伝子のクロ-ニングと鉄酸化細菌への導入

铁氧化细菌铁氧化酶基因的克隆及导入铁氧化细菌中

基本信息

批准号：
63560094
负责人：
草野友延
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Akita Prefectural College of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至 1990
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63560094/
关键词：
鉄酸化細菌鉄酸化酵素遺伝子クロ-ニングクローニング

项目摘要

1.標記酵素は鉄酸化細菌Fe1株よりSDSーPAGE的に均一に精製され、N末端のアミノ酸配列が決定されている。東工大山中教授からの私信に基ずき、18merと21merの2種のオリゴヌクレオチドを化学合成しプロ-ブとして用いた。2.Fe1株の染色体DNAを調整し、EcoRI,PstIのプラスミドライブラリ-を構築した。これらのライブラリ-より1で述べたプロ-ブを用いて4c22塩基対からなるEcoRI断片として目的クロ-ンを単離した。3.塩基配列決定の結果、目的遺伝子は255塩基対の短い読み枠を有していた。84ケのアミノ酸配列のうち31ケはシグナル配列を形成し、成熟酵素のサブユニット部分はわずか53ケのアミノ酸よりなっていた。これは、精製酵素サブユニットの分子量が8,000以下である事とも一致した結果である。4.現在、大腸菌用発現ベクタ-にのせて大腸菌での本酵素の発現を試みている。5.得られた4Kbの断片上には目的遺伝子の他に1290塩基対よりなるプリン生合成に関与するpurA遺伝子も存在している事が判明している。6.鉄酸化細菌の宿主ベクタ-系構築に必要な選択マ-カ-遺伝子として、Eー15株由来の水銀耐性遺伝子を単離し、遺伝子構成を明らかにした。現在、この遺伝子を用いてシャトルベクタ-の構築、導入を試みている。

1. 标题酶已从铁氧化菌 Fe1 菌株中通过 SDS-PAGE 纯化至均一，并确定了 N 端的氨基酸序列。根据东京工业大学山中伸弥教授的私人信件，化学合成了两种类型的寡核苷酸：18mer 和 21mer，并用作探针。 2.对Fe1菌株染色体DNA进行调整，构建EcoRI和PstI质粒文库。使用 1 中描述的探针从这些文库中分离出目标克隆，作为由 4c22 个碱基对组成的 EcoRI 片段。 3. 碱基测序结果显示，目的基因具有255个碱基对的短阅读框。 84个氨基酸序列中的31个形成信号序列，成熟酶的亚基部分仅由53个氨基酸组成。该结果与纯化的酶亚基的分子量为8,000以下的事实一致。 4.目前，我们正在尝试使用大肠杆菌表达载体在大肠杆菌中表达该酶。 5.除了目的基因外，发现在获得的4Kb片段上还存在参与嘌呤生物合成的1290碱基对purA基因。 6.分离了源自菌株E-15的汞抗性基因，作为构建铁氧化细菌宿主载体系统所需的选择标记基因，并阐明了其基因结构。我们目前正在尝试使用该基因构建和引入穿梭载体。