cryoEM-NMR融合構造解析の確立

冷冻电镜核磁共振融合结构分析的建立

基本信息

批准号：
22K18359
负责人：
加藤貴之
金额：
$ 16.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

近年クライオ電子顕微鏡による構造解析の分解能は飛躍的に改善し、構造生物学において欠かすことのできない手法に成長した。特に大きな複合体や柔軟な構造を持つような分子には第一選択的に用いられ、創薬にも用いられるようになった。しかし、部分分解能に関しては必ずしも高くなく、溶媒に面している領域では側鎖まで可視化できることはそれほど多くない。一方NMRは構造解析の手法としては溶液中の運動性を評価で利点を持っているが、大きな分子には構造解析できないことや同位体ラベルする必要性があることなど欠点を持つ。しかしこの2つの技術は互いに補うことが可能であり、クライオ電子顕微鏡で主鎖構造を、NMRで側鎖の相対的な位置を解析できれば、運動性を含んだ高分解能な構造解析が可能である。そこで、まずNMRで同位体ラベルをせずにHのみのシグナルから原子間の距離情報を取得する方法を模索することにした。同位体ラベルなしの場合、クライオ電子顕微鏡での観察試料をそのままNMR測定に持ち込むことができるため、利便性が高く汎用性を求めるためには必須である。今回標準サンプルとしてすでに構造が解析されているTET2を用いて実験を行った。TET2は分子量約450 kDaの複合体であり、そこからのHのシグナルは非常に多く2次元に展開してなお、互いに重なり合い帰属に使うことはできず、距離情報を得ることは困難であった。しかし、フェニルアラニンやトリプトファンなど芳香族アミノ酸に由来するHのシグナルは他のアミノ酸由来のHのシグナルとは異なる化学シフトを持つため、その由来を知る可能性があることがわかった。また、重なり合ったシグナルも、既知構造から各原子由来のシグナルの位置を予測するプログラムを使うことで帰属が可能となる可能性を見出した。

近年来，冷冻电镜结构分析的分辨率显着提高，已成为结构生物学中不可或缺的方法。它被用作具有特别大的复合物和灵活结构的分子的首选，并且也被用于药物发现。然而，部分分辨率不一定高，并且通常不可能可视化面向溶剂的区域中的侧链。另一方面，NMR作为一种结构分析方法，具有评价溶液中迁移率的优点，但也存在无法分析大分子结构、需要同位素标记等缺点。然而，这两种技术可以相互补充，如果可以使用冷冻电子显微镜分析主链结构，并且可以使用核磁共振分析侧链的相对位置，则包括迁移率的高分辨率结构分析将成为可能。因此，我们首先决定寻找一种方法，仅使用 NMR 信号从 H 信号中获取原子之间的距离信息，而无需同位素标记。如果没有同位素标记，用冷冻电子显微镜观察的样品可以直接进行核磁共振测量，这对于高度的便利性和多功能性至关重要。这次，我们使用结构已经分析出来的TET2作为标准样品进行实验。 TET2是一种分子量约为450 kDa的复合物，尽管其大量的H信号在二维展开，但它们相互重叠，无法用于分配，导致距离信息难以获得。。然而，人们发现，源自苯丙氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的H信号与源自其他氨基酸的H信号具有不同的化学位移，因此有可能了解它们的起源。他们还发现，可以通过使用从已知结构预测每个原子衍生信号的位置的程序来分配重叠信号。