cryoEM-NMR融合構造解析の確立

冷冻电镜核磁共振融合结构分析的建立

基本信息

批准号：
22K18359
负责人：
加藤貴之
金额：
$ 16.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

近年クライオ電子顕微鏡による構造解析の分解能は飛躍的に改善し、構造生物学において欠かすことのできない手法に成長した。特に大きな複合体や柔軟な構造を持つような分子には第一選択的に用いられ、創薬にも用いられるようになった。しかし、部分分解能に関しては必ずしも高くなく、溶媒に面している領域では側鎖まで可視化できることはそれほど多くない。一方NMRは構造解析の手法としては溶液中の運動性を評価で利点を持っているが、大きな分子には構造解析できないことや同位体ラベルする必要性があることなど欠点を持つ。しかしこの2つの技術は互いに補うことが可能であり、クライオ電子顕微鏡で主鎖構造を、NMRで側鎖の相対的な位置を解析できれば、運動性を含んだ高分解能な構造解析が可能である。そこで、まずNMRで同位体ラベルをせずにHのみのシグナルから原子間の距離情報を取得する方法を模索することにした。同位体ラベルなしの場合、クライオ電子顕微鏡での観察試料をそのままNMR測定に持ち込むことができるため、利便性が高く汎用性を求めるためには必須である。今回標準サンプルとしてすでに構造が解析されているTET2を用いて実験を行った。TET2は分子量約450 kDaの複合体であり、そこからのHのシグナルは非常に多く2次元に展開してなお、互いに重なり合い帰属に使うことはできず、距離情報を得ることは困難であった。しかし、フェニルアラニンやトリプトファンなど芳香族アミノ酸に由来するHのシグナルは他のアミノ酸由来のHのシグナルとは異なる化学シフトを持つため、その由来を知る可能性があることがわかった。また、重なり合ったシグナルも、既知構造から各原子由来のシグナルの位置を予測するプログラムを使うことで帰属が可能となる可能性を見出した。

近年来，使用冷冻电子显微镜的结构分析的分辨率已大大改善，并已成长为结构生物学中必不可少的方法。它已被先选择用于具有柔性结构的大型复合物和分子，并且也已用于药物发现中。但是，部分分辨率不一定很高，并且通常不可能看到面向溶剂的区域的侧链。另一方面，NMR在评估溶液中作为结构分析技术的迁移率具有优势，但是它具有诸如无法分析大分子结构的缺点，并且需要标记同位素。但是，这两种技术可以相互补充，如果可以使用冷冻电子显微镜分析主链结构，并使用NMR使用NMR的侧链相对位置，则可以实现高分辨率结构分析，包括运动。因此，我们首先决定探索一种方法，以获取原子之间的距离信息，而无需NMR的同位素标记。当不存在同位素标签时，可以将使用冷冻电子显微镜观察到的样品直接将其带入NMR测量中，这对于高便利性和多功能性至关重要。这次，我们使用TET2进行了一个实验，该实验已经被分析为标准样本。 TET2是一种复合物，分子量约为450 kDa，即使来自其的H信号非常大，也很难获得距离信息，即使它极为广泛并且在两个维度上展开，也不能用于彼此分配给另一个维度，因此很难获得距离信息。但是，已经发现，源自芳族氨基酸（例如苯丙氨酸和色氨酸）的H信号与来自其他氨基酸的H信号不同，并且可以知道H信号的起源。还发现，可以使用一个程序来预测从已知结构中每个原子得出的信号位置来分配重叠信号。