Development of in situ SPA with wedge-shaped sample

楔形样品原位 SPA 的开发

基本信息

批准号：
22H02559
负责人：
加藤貴之
金额：
$ 11.23万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

タンパク質は生命活動の根幹であり、タンパク質の機能異常は病気を引き起こす。また、ウイルスなどの病原体は特定のタンパク質に結合することで感染が開始されるため、タンパク質を知ることは病気の治療や創薬のおいて最も重要な要素である。近年の創薬は構造情報に基づいた"Structure based drug design"が主流である。そのため、自然な状態のタンパク質の構造情報を得る手法は創薬の基盤技術になり得る。一般的に創薬に用いることができる高分解能な構造情報は細胞内から精製されたタンパク質を用いられ、細胞内で今まさに機能しているタンパク質の構造情報を高分解能で得る方法は未だに確立していない。本研究では凍結させた細胞を収束イオンビーム（FIB）を用いて、楔形に切削し、十分に薄い場所のみをクライオ電子顕微鏡にて撮影し、単粒子解析法を用いて細胞内のタンパク質の構造を解析する方法を確立することを目的としている。FIBは試料を非常に薄く切削できるが、通常の方法では高分解能な情報を得るには不十分であるため、まず楔形試料の切削の条件を検討した。特に自動切削と組み合わせた場合の１試料の作成時間、FIB装置からクライオ電子顕微鏡まで移送する際の力学的な安定性の注意し、実験を行なった。標準サンプルである酵母を用いて楔形試料の作成を試みたところ、手前が厚く奥が薄い楔形の試料を作成することに成功したが、奥の薄い部分の厚さは一定ではなく、リアス式海岸のように不均一に削られることが確認された。そこで手前が薄く奥が厚い逆楔形にすると比較的均等に薄い試料を作成することができた。自動切削を使ってある程度の厚さまで削った後、手動で楔形を作成することで、８時間に7箇所程度の楔を作成することができた。

蛋白质是生命活动的基础，蛋白质的功能失调会导致疾病。此外，病毒等病原体通过与特定蛋白质结合来引发感染，因此了解蛋白质是疾病治疗和药物发现中最重要的要素。近年来，药物发现的主流是基于结构信息的“基于结构的药物设计”。因此，获取天然状态蛋白质结构信息的方法可以成为药物发现的基础技术。一般来说，可用于药物发现的高分辨率结构信息是从细胞内纯化的蛋白质中获得的，而获得目前在细胞内发挥作用的蛋白质的高分辨率结构信息的方法尚未建立。在这项研究中，使用聚焦离子束（FIB）将冷冻细胞切成楔形，并使用冷冻电子显微镜仅拍摄足够薄的区域。这项研究的目的是建立一种分析方法。 FIB可以切割非常薄的样品，但由于传统方法不足以获得高分辨率信息，我们首先研究了切割楔形样品的条件。该实验特别关注与自动切割相结合的一个样品的制备时间以及从 FIB 设备转移到冷冻电子显微镜期间的机械稳定性。当我们尝试使用酵母（作为标准样品）制作楔形样品时，我们成功制作了前面较厚、后面较薄的楔形样品，但后面较薄部分的厚度不恒定，看起来像里亚海岸，确认表面被刮得不均匀。因此，通过创建前部较薄、后部较厚的倒楔形形状，我们能够创建相对均匀的薄样品。使用自动切割切割到一定厚度后，我们能够通过手动创建楔形形状，在 8 小时内在大约 7 个位置创建楔形。

项目成果

期刊论文数量（1）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Cryo-CLEM 法およびCryo-ET 法による糸状仮足先端の三次元構造観察

利用 Cryo-CLEM 和 Cryo-ET 方法观察丝状伪足尖端的三维结构

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Miho Nakafukasako;Tomoya Higo;Yuki Gomibuchi;Hiroko Takazaki;Yusuke V. Morimoto,Takayuki Kato;Takuo Yasunaga
通讯作者：
Takuo Yasunaga