アルドラーゼＡを介した異常型プリオン蛋白侵入機構の解明と牛海綿状脳症予防への応用

醛缩酶A介导的异常朊病毒蛋白侵袭机制的阐明及其在预防牛海绵状脑病中的应用

基本信息

批准号：
13J02872
负责人：
長澤裕哉
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02872/
关键词：
プリオンアルドラーゼA M細胞

项目摘要

牛海綿状脳症はウシのプリオン病であり、日本及び世界の畜産業の関連産業に大きな打撃を与えた。そのため、牛海綿状脳症の全容解明が望まれている。近年、牛海綿状脳症の感染は、腸管M細胞が異常型プリオンを取り込んで輸送小胞として基底側へトランスサイトーシスを行うことが報告され、M細胞を介して行われることが明らかとなった。しかし、ウシ腸管上皮M細胞におけるプリオン蛋白質取り込みに関わる詳細な研究は行われていない。申請者はプリオン蛋白質取り込みに深く関わる蛋白質としてアルドラーゼAを同定し、アルドラーゼAがプリオン蛋白質と親和性を持ち、異常型プリオン蛋白質取り込み部位で強く発現していることを明らかにしてきた。本研究では、アルドラーゼAに焦点を当て、アルドラーゼAが異常型プリオン蛋白質の感染に関与する蛋白質であることを解明する目的で研究を進めた。アルドラーゼAは、M細胞表面、輸送小胞中、神経線維芽細胞株およびマウスの中枢神経中においても強く発現していることが免疫染色の結果明らかとなった。また、当研究室で樹立したM細胞に分化誘導能を持つマウスおよびウシ腸管上皮細胞をトランズウェルに播種してM細胞に分化誘導させた後にBIE細胞を抗アルドラーゼA抗体で処理し、異常型プリオン蛋白質を添加した。培養9時間後に下部培地を回収し、プロテアーゼK処理後にウェスタンブロット解析を行い、異常型プリオン蛋白質を検出した。その結果、下部培地中の異常型プリオン蛋白質が抗体処理により抑制された。また、人工DNAヌクレアーゼTALENを用いてアルドラーゼAノックアウト細胞を作製し、同様の実験を行った結果、M細胞における異常型プリオン蛋白質の取り込みが抑制された。以上より、M細胞表面に存在するアルドラーゼAを抗体で処理することにより、M細胞における異常型プリオン蛋白質取り込みが抑制されることが判明した。

牛海绵状脑病是一种牛朊病毒病，对日本和世界各地的畜牧相关产业产生了重大影响。因此，需要彻底阐明牛海绵状脑病。近年来，据报道，肠道M细胞摄取异常朊病毒，并将其作为转运囊泡转运至基底侧，并且已经明确牛海绵状脑病的感染是通过M细胞发生的。然而，尚未对牛肠上皮M细胞摄取朊病毒蛋白进行详细研究。申请人将醛缩酶A鉴定为与朊病毒蛋白摄取密切相关的蛋白质，并表明醛缩酶A对朊病毒蛋白具有亲和力，并且在异常朊病毒蛋白摄取部位强烈表达。在本研究中，我们关注醛缩酶A，目的是阐明醛缩酶A是一种参与异常朊病毒蛋白感染的蛋白质。免疫染色显示醛缩酶 A 在 M 细胞表面、运输囊泡、神经成纤维细胞系和小鼠中枢神经系统中强烈表达。另外，将本实验室建立的具有诱导分化为M细胞能力的小鼠和牛肠上皮细胞接种到Transwell中诱导分化为M细胞，然后用抗醛缩酶A抗体处理BIE细胞，产生异常细胞添加了朊病毒蛋白。培养9小时后，收集下层培养基，用蛋白酶K处理，进行Western blot分析，检测异常朊病毒蛋白。结果，下层培养基中的异常朊病毒蛋白被抗体处理所抑制。此外，当使用人工DNA核酸酶TALEN使用醛缩酶A敲除细胞进行类似实验时，M细胞中异常朊病毒蛋白的摄取被抑制。由上可知，通过用抗体处理M细胞表面的醛缩酶A，可以抑制异常朊病毒蛋白向M细胞的摄取。