角層バリア形成の分子基盤の解析

角质层屏障形成的分子基础分析

基本信息

批准号：
17K16359
负责人：
葛野菜々子
金额：
$ 2.41万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17K16359/
关键词：
syntaxin-4 角化ノックアウトバリア

项目摘要

1. 表皮「上層」で特異的にSyntaxin-4をノックアウトしたSyntaxin-4コンディショナルノックアウトマウスを作製し、Syntaxin-4のCE形成における役割を解析する。そのために、前年度に表皮上層プロモーター (SASPase、Involucrin 、Keratin-1) 下でCreを発現するヘアレスマウスの作製に着手した。今年度は各Creマウスを、Cre/loxPによる組換えによりtdTomatoを発現するマウスと交配することでCreによる組換えが皮膚表皮のどの層から起こるのかを明らかにした。また、前年度に作成を開始したSyntaxin-4 floxマウスはキメラマウスのセレクション・CAG-Flpマウスと交配を終え、表皮上層特異的にCreを発現する各マウスとSyntaxin-4 floxマウスを交配中である。2. 生体マウス表皮に外来遺伝子をまだらに導入する方法の確立に成功した。そこでSyntaxin-4とEGFPの融合タンパク質を発現するプラスミドを生体マウス表皮に導入し、Syntaxin-4を強制発現した影響を顕微鏡下で観察した結果、Syntaxin-4が角化に影響を与える可能性が示唆された。3. CE形成過程におけるSyntaxin-4の影響を解析するためにCRISPR/Cas9システムを用いSASPaseプロモーター下流にSyntaxin-4とEGFPの配列を挿入したマウスを作成した。Syntaxin4とEGFPの融合タンパク質を発現するマウスが1匹生まれたが、そのマウスは正常ではなく全身が硬い膜のような組織に覆われていた。このマウスの皮膚切片を作成し観察した結果、Syntaxin-4とEGFPの融合タンパク質は表皮上層で発現しており、このマウスの角質層は正常なマウスに比べて厚かった。

1. 生成Syntaxin-4条件敲除小鼠，其中Syntaxin-4在表皮“上层”被特异性敲除，并分析Syntaxin-4在CE形成中的作用。为此，我们从前一年开始培育在上表皮启动子（SASPase、Involucrin、Keratin-1）下表达 Cre 的无毛小鼠。今年，我们通过将每只 Cre 小鼠与通过 Cre/loxP 重组表达 tdTomato 的小鼠杂交，阐明了 Cre 重组发生在皮肤表皮的哪一层。此外，我们去年开始创建的 Syntaxin-4 flox 小鼠已与嵌合小鼠选择和 CAG-Flp 小鼠杂交，目前我们正在将 Syntaxin-4 flox 小鼠与特异性表达 Cre 的小鼠杂交。上表皮层。 2、成功建立了将外源基因成片导入活体小鼠表皮的方法。因此，我们将表达Syntaxin-4和EGFP融合蛋白的质粒导入活体小鼠的表皮中，并在显微镜下观察Syntaxin-4强制表达的效果，结果发现Syntaxin-4可能影响角质化。。 3.为了分析Syntaxin-4对CE形成过程的影响，我们使用CRISPR/Cas9系统创建了将Syntaxin-4和EGFP序列插入SASPase启动子下游的小鼠。一只小鼠出生时就表达了 Syntaxin4 和 EGFP 的融合蛋白，但它并不正常，它的整个身体都被硬膜状组织覆盖。制备并观察该小鼠的皮肤切片，结果发现Syntaxin-4和EGFP的融合蛋白在表皮上层表达，并且该小鼠的角质层比正常小鼠厚。