モルヒネの微生物生産システム構築のためのベルベリン炭素骨格開裂機構の解明

阐明小檗碱碳骨架裂解机制构建吗啡微生物生产系统

• 批准号: 17K15470
• 负责人: 石川 和樹
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Hoshi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17K15470/
• 关键词: モルヒネ; アルカロイド; ベルベリン; Rhodococcus; 微生物生産

[Step 1] BCE 候補遺伝子の探索Rhodococcus sp. BD7100株におけるBCE候補遺伝子の選抜を目的に、トランスポゾン挿入BBR分解能欠損株のひとつであるTB537株のドラフトゲノムシーケンスを行った。その結果、トランスポゾンがORF6192とORF6193の遺伝子間領域に挿入されていることが明らかになった。さらに、新たにBBR資化性菌として単離したArthrobacter sp. GBD-1株のBBR分解能を解析した結果、BD7100株と類似したBBR分解経路（分解産物としてD-BBRおよびseco-D-BBRを検出）を有している可能性が示唆された。そこで、ドラフトゲノム情報から特定したBBR脱メチレン遺伝子brdA(ORF4430)の近傍に存在し、BD7100株のbrdAの近傍に存在する遺伝子と相同性を示す遺伝子の破壊株を作製した。各破壊株の休止菌体を用いてseco-D-BBR産生能を評価した結果、ORF4420破壊株においてseco-D-BBRの生産能が消失していた。以上の結果からBD7100株由来遺伝子ORF6191,6192およびGBD-1株由来ORF4420をBCE候補遺伝子とした。[Step 2] BCE 遺伝子の特定Step 1で選抜した候補遺伝子のBBR骨格開裂反応への関与を検証するために、各遺伝子をRhodococcus sp.発現用ベクターpTip-QC1にbrdAと共に導入したベクターを作製した。これらをRhodococcus sp. PR4株にそれぞれ導入し、得られた形質転換体の休止菌体のBBR分解能を検証した。その結果、形質転換体の休止菌体によるD-BBRへの変換は確認できたが、seco-D-BBRの産生は確認できなかった。そのため、現段階ではBCEの特定には至っていない。

[步骤1]搜索BCE候选基因以选择犀牛Sp中的BCE候选基因。 BD7100菌株，我们进行了菌株TB537的草稿基因组序列，这是转座子插入的BBR分辨率缺陷菌株之一。结果表明，转座子被插入ORF6192和ORF6193的基因间区域。此外，分析节肢动物sp的BBR分辨率。 GBD-1菌株是新近分离为BBR疗法细菌的菌株，表明它的BBR降解途径可能与菌株BD7100相似（检测D-BBR和SECO-D-BBR作为降解产物）。因此，从基因组信息草案中鉴定出BBR脱甲基因BRDA（ORF4430）附近存在的基因的破坏菌株，并与存在于BD7100菌株BRDA附近的基因同源。使用每个破坏性菌株的静息细胞评估产生SECO-D-BBR的能力，并丢失了在ORF4420中断菌株中产生SECO-D-BBR的能力。基于上述结果，从BD7100菌株和来自GBD-1菌株的ORF4420的基因ORF6191,6192用作BCE候选基因。 [步骤2]鉴定BCE基因，以验证步骤1中在BBR主链裂解反应中选择的候选基因的参与，该载体裂解反应是将每个基因引入Rhodococcus sp的载体。制备了表达载体PTIP-QC1以及BRDA。这些被引入犀牛Sp。验证了PR4菌株以及所得转化体的静息细胞的BBR分辨率。结果，通过静息细胞将转化剂转化为D-BBR，但无法确认SECO-D-BBR的产生。因此，在此阶段，尚未确定公元前。

项目成果

ベルベリン資化性菌Rhodococcus sp. BD7100株がオウレンエキス添加培養時に産生する抗菌物質に関する検討

小檗碱同化菌红球菌 BD7100 菌株与 Orensis 提取物培养时产生抗菌物质的研究

• 发表时间: 2017
• 作者: 石川和樹;吉田陽菜花;武田尚;若菜大悟;東條元昭;佐藤文彦;細江智夫
• 通讯作者: 細江智夫

星薬科大学薬化学教室

星药科大学药物化学系