1分子蛍光イメージング法による分子シャペロニンの蛋白質折れたたみ機構解析

单分子荧光成像方法分析分子伴侣蛋白的蛋白质折叠机制

基本信息

批准号：
15032254
负责人：
多田隈尚史
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分子シャペロンは蛋白質の折れたたみを手助けする酵素である。申請者らは1分子蛍光イメージング法を用いて分子シャペロンの一種であるシャペロニンGroELとGroESの結合解離過程を解析し、従来はATPの加水分解が唯一の律速過程と考えられていたシャペロニンの変性蛋白質折れたたみサイクルに未知の中間状態が存在する事を示した。本研究ではこれらの成果を発展させ、以下の成果を得た。1.チロシンの蛍光による構造変化の検出シャペロニンGroELはATPが結合することで大きく構造変化する。チロシン残基の蛍光強度を測定する事でGroELの構造変化をリアルタイムにモニターできる事がわかった。変異体解析により強度変化は506番目のチロシン由来だと判明した。また、変性蛋白質非存在下のサイクルを解析した所、3つの中間状態があり、変異体を用いる事でそれらの状態と構造変化の相関を関連付けられた。2.未知の中間状態の解析未知の中間状態の分子的実態の解明を目指して、より詳細な解析を行った。蛍光エネルギー移動法を用いて、フタであるGroESが結合してからの変性蛋白質のGroEL内部での動きを計測した所、GroESが結合してから、少なくとも3つの中間状態を経てからGroEL外へ放出される事がわかった。これらの結果からGroEL-ESの反応サイクルには変性蛋白質を確実にGroEL内に閉じ込める機構があり、折れたたみ効率を向上させていることわかった。3.高速溶液交換システムの開発1分子蛍光イメージングは観察時の蛍光色素濃度が50nM程度に限定される。しかし、実際の生体反応ではより高濃度の領域で起きる反応が多い。そこで一時的に高濃度試料の溶液を流し反応を開始させた後、瞬時に観察可能な濃度まで蛍光色素を低減することで、この限界の克服を試みた。その結果、現時点では0.2秒で溶液濃度を交換出来ることが分かった。

分子伴侣是帮助蛋白质折叠的酶。申请人利用单分子荧光成像分析了分子伴侣之一的伴侣蛋白GroEL和GroES的结合和解离过程，发现伴侣蛋白是一种变性蛋白质，以前认为其唯一的速率是ATP水解。 -限制过程表明，折叠循环中存在未知的中间状态。在本研究中，我们扩展了这些结果并获得了以下结果。 1. 使用酪氨酸荧光伴侣蛋白检测结构变化 GroEL 在与 ATP 结合后会发生较大的结构变化。我们发现通过测量酪氨酸残基的荧光强度可以实时监测 GroEL 的结构变化。突变体分析表明强度的变化源自第506位酪氨酸。此外，当我们在没有变性蛋白质的情况下分析循环时，存在三种中间状态，并且通过使用突变体，我们能够将这些状态与结构变化相关联。 2.未知中间态的分析进行了更详细的分析，目的是阐明未知中间态的分子现实。利用荧光能量转移，我们测量了变性蛋白质在与 GroES（即盖子）结合后在 GroEL 内的运动，发现在与 GroES 结合后，它在被释放到 GroEL 外部之前至少经历了三个中间状态。它会发生。这些结果表明，GroEL-ES 反应循环具有可靠地将变性蛋白质限制在 GroEL 内的机制，从而提高折叠效率。 3.开发高速溶液交换系统单分子荧光成像在观察过程中仅限于约50nM的荧光染料浓度。然而，在实际的生物反应中，许多反应是在较高浓度下发生的。因此，我们试图通过暂时注入高浓度样品溶液来启动反应，然后将荧光染料降低至可以瞬时观察到的浓度来克服这一限制。结果发现，目前可以在0.2秒内完成溶液浓度的交换。