1分子蛍光イメージング法による分子シャペロニンの蛋白質折れたたみ機構解析

单分子荧光成像方法分析分子伴侣蛋白的蛋白质折叠机制

基本信息

批准号：
14037266
负责人：
多田隈尚史
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分子シャペロンは蛋白賃の折れたたみを手助けする酵素である。申請者らは1分子蛍光イメージング法を用いて分子シャペロンの一種であるシャペロニンGroELとGroESの結合解離過程を解析し、従来はATPの加水分解が唯一の律速過程と考えられていたシャペロニンの変性蛋白質折れ畳サイクルに未知の中間状態が存在する事を示した。本研究ではこれらの成果を発展させ、以下の成果を得た。1.チロシンの蛍光による構造変化の検出シャペロニンGroELはATPが結合することで大きく構造変化する。チロシン残基の蛍光強度を測定する事でGroELの構造変化をリアルタイムにモニターできる事がわかった。また、変異体を用いた解析により、この蛍光強度変化は、GroELのサブユニットに7残基あるチロシンのうち506番目のチロシン由来である事を特定できた。2.未知の中間体の解析未知の中間体の分子的実体の解明を目指して、より詳細な解析を行った。その結果、この中間体はATPの加水分解と密接に関連している事が明らかになった。また、この中間体の状態では変性タンパク質はGroELのヘリに結合したままで折れたたみ反応がさえぎられており、ふたであるGroESが結合した後一定時間を経ないと、GroELの空洞の中に放出されない事が分かった。この仕組みにより、変性タンパク質はGroELの中に確実に閉じ込められ、その結果、折れたたみ効率が向上していると考えられた。3.プレフォルディンとシャペロニンの相互作用の解析プレフォルディンは真核生物でアクチン等の折れたたみに必須な蛋白質であり、シャペロニンと相互作用することが知られている。本研究ではプレフォルディン、変性蛋白質、シャペロニンをそれぞれ蛍光標識し、蛍光顕微鏡下で観察を行い、平衡定数(kd)を実測した。また、プレフォルディンからの変性蛋白質の解離がシャペロニンによって促進される事を見出した。

分子伴侣是有助于分解蛋白质工资的酶。申请人使用单个分子荧光成像方法分析了伴侣蛋白凹槽和凹槽的键离解过程，一种分子伴侣酮，表明伴侣蛋白的变性蛋白破裂循环中存在一个未知的中间状态，以前被认为是唯一的速率限制过程。这项研究开发了这些结果并达到了以下结果：1。检测酪氨酸荧光伴侣凹槽引起的结构变化，当ATP结合时会发生重大的结构变化。发现可以通过测量酪氨酸残基的荧光强度实时监测凹槽的结构变化。此外，使用突变体的分析使我们能够确定这种荧光强度的变化源自酪氨酸，酪氨酸的数字506，在Groel亚基中有七个残基。 2。对未知中间体的分析进行了更详细的分析，目的是阐明未知中间体的分子实体。结果表明，该中间体与ATP的水解密切相关。此外，发现在这种中间状态下，变性蛋白保持与Groel直升机的结合，并且断裂反应被阻塞，并且没有将其释放到Groel的空腔中，除非自从Groes以来已经通过了一定的时间，但盖子已结合。该机制确保了变性蛋白被困在凹槽中，从而提高了折叠效率。 3。对蛋白质和其他物质破裂的真核生物中必不可少的蛋白质之间的相互作用分析是与伴侣蛋白相互作用的真核生物中必不可少的蛋白质。在这项研究中，对荧光标记预成贡，变性蛋白和伴侣蛋白被标记，并在荧光显微镜下观察以确定平衡常数（KD）。还发现，伴侣蛋白促进了变性蛋白与前贡蛋白的解离。