1分子蛍光イメージング法による分子シャペロニンの蛋白質折れたたみ機構解析

单分子荧光成像方法分析分子伴侣蛋白的蛋白质折叠机制

基本信息

批准号：
14037266
负责人：
多田隈尚史
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分子シャペロンは蛋白賃の折れたたみを手助けする酵素である。申請者らは1分子蛍光イメージング法を用いて分子シャペロンの一種であるシャペロニンGroELとGroESの結合解離過程を解析し、従来はATPの加水分解が唯一の律速過程と考えられていたシャペロニンの変性蛋白質折れ畳サイクルに未知の中間状態が存在する事を示した。本研究ではこれらの成果を発展させ、以下の成果を得た。1.チロシンの蛍光による構造変化の検出シャペロニンGroELはATPが結合することで大きく構造変化する。チロシン残基の蛍光強度を測定する事でGroELの構造変化をリアルタイムにモニターできる事がわかった。また、変異体を用いた解析により、この蛍光強度変化は、GroELのサブユニットに7残基あるチロシンのうち506番目のチロシン由来である事を特定できた。2.未知の中間体の解析未知の中間体の分子的実体の解明を目指して、より詳細な解析を行った。その結果、この中間体はATPの加水分解と密接に関連している事が明らかになった。また、この中間体の状態では変性タンパク質はGroELのヘリに結合したままで折れたたみ反応がさえぎられており、ふたであるGroESが結合した後一定時間を経ないと、GroELの空洞の中に放出されない事が分かった。この仕組みにより、変性タンパク質はGroELの中に確実に閉じ込められ、その結果、折れたたみ効率が向上していると考えられた。3.プレフォルディンとシャペロニンの相互作用の解析プレフォルディンは真核生物でアクチン等の折れたたみに必須な蛋白質であり、シャペロニンと相互作用することが知られている。本研究ではプレフォルディン、変性蛋白質、シャペロニンをそれぞれ蛍光標識し、蛍光顕微鏡下で観察を行い、平衡定数(kd)を実測した。また、プレフォルディンからの変性蛋白質の解離がシャペロニンによって促進される事を見出した。

分子伴侣是帮助蛋白质折叠的酶。申请人利用单分子荧光成像分析了分子伴侣之一的伴侣蛋白GroEL和GroES的结合和解离过程，发现伴侣蛋白是一种变性蛋白质，以前认为其唯一的速率是ATP水解。 -限制过程表明，折叠循环中存在未知的中间状态。在本研究中，我们扩展了这些结果并获得了以下结果。 1. 使用酪氨酸荧光伴侣蛋白检测结构变化 GroEL 在与 ATP 结合后会发生较大的结构变化。我们发现通过测量酪氨酸残基的荧光强度可以实时监测 GroEL 的结构变化。此外，使用突变体进行的分析表明，这种荧光强度的变化源自GroEL亚基中7个酪氨酸残基中的第506个酪氨酸。 2.未知中间体的分析进行了更详细的分析，目的是阐明未知中间体的分子实体。结果表明该中间体与ATP水解密切相关。另外，在这种中间状态下，变性的蛋白质仍然与GroEL的下摆结合，折叠反应被阻断，如果在盖子GroES结合后没有经过一定的时间，它就会被释放到GroEL的腔内我发现这不会发生。人们认为这种机制确保变性蛋白质被限制在 GroEL 内，从而提高折叠效率。 3.前折叠蛋白和伴侣蛋白之间相互作用的分析前折叠蛋白是真核生物中肌动蛋白和其他蛋白质折叠所必需的蛋白质，并且已知与伴侣蛋白相互作用。在本研究中，我们对前折叠蛋白、变性蛋白和伴侣蛋白进行荧光标记，在荧光显微镜下观察它们，并测量它们的平衡常数（kd）。我们还发现伴侣蛋白促进了变性蛋白从前折叠蛋白的解离。