核内におけるイントロン分解とスプライシング因子のリサイクル機構の解明

阐明细胞核内含子降解和剪接因子回收机制

• 批准号: 15030222
• 负责人: 片岡 直行
• 金额: $ 3.78万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15030222/
• 关键词: RNAスプライシング; イントロン; エクソン; ラリアット構造; 脱ブランチ反応

真核生物の核にコードされる遺伝子の多くは、イントロンと呼ばれる介在配列によって分断化されている。このことにより、核内で合成されたmRNA前駆体が、細胞質において蛋白質合成の鋳型として機能するためには、イントロンを取り除きエクソン同士を連結するRNAスプライシングが必須である。スプライシングにより切り出されたイントロンは核内にとどまり、スプライシング因子が除去された後、分解されると考えられている。ヒトではイントロンはmRNA前駆体の実に95%を占めている。またイントロン上にはsnoRNAやmicroRNAなどの遺伝子発現調節に関わるnon coding RNAがコードされていることからも、イントロンの代謝は高等真核生物において重要だと思われるが、ほとんど解析されていない。本研究では、核内でのイントロンの代謝とそれに伴うスプライシング因子のリサイクル機構を解明することを目的としている。そこでこれまでに同定されている二つの因子、hDBR1とhPRP43に注目した。hDBR1と複合体を形成している因子を同定するため、培養細胞でFlagタグを付けたhDBR1とその不活性化変異体を発現させ、Flagタグに対する抗体を用いて免疫沈降を行った。その結果、新規のタンパク質因子を同定した。またin vitroでの結合実験より、この因子はhDBR1と特異的に結合することを確認した。またheterokaryon実験により、hDBR1が核と細胞質を往復する活性があることがわかり、細胞質での機能が示唆された。またRNAヘリケース様タンパク質であるhPRP43のヘリケースモチーフに変異を導入し、変異体をin vitroスプライシング反応に用いたところ、切り出されたラリアット型イントロンが安定化し、変異体タンパク質とともに沈降するのがみられた。

真核生物核中编码的许多基因被称为内含子的中间序列碎片。因此，对于在细胞核中合成的mRNA前体而言，可以充当细胞质中蛋白质合成的模板，RNA剪接将内含子和外显子一起去除内含子和链接是必不可少的。据信，通过剪接切除的内含子保留在核中，并在去除剪接因子后降解。在人类中，内含子占mRNA前体的95％。此外，在内含子上编码了参与基因表达（例如SNORNA和microRNA）调节的非编码RNA，因此内含子代谢在较高的真核生物中似乎很重要，但几乎没有被分析。这项研究旨在阐明核中内含子的代谢以及伴随它们的剪接因子的回收机制。因此，我们专注于迄今为止确定的两个因素：HDBR1和HPRP43。为了鉴定与HDBR1复合的因素，培养的细胞表达了标记为FLAG标记的HDBR1及其灭活突变体，并使用针对标记的标记的抗体进行了免疫沉淀。结果，发现了新的蛋白质因子。此外，体外结合实验证实了该因子特异性与HDBR1结合。此外，Heterokaryon实验表明，HDBR1具有在细胞核和细胞质之间进行回报的活性，这表明其在细胞质中的功能。此外，将突变引入了HPRP43的螺旋病例基序中，RNA螺旋病例样蛋白，当突变体用于体外剪接反应中时，切除的肉芽型内含子被稳定并与突变蛋白一起沉淀。

项目成果

片岡直行: "脊髄性筋萎縮症(SMA)の分子生物学"蛋白質核酸酵素・増刊「RNAの細胞生物学」. 48・4. 524-531 (2003)

片冈直之：“脊髓性肌萎缩症（SMA）的分子生物学”蛋白质核酸酶特别版“RNA的细胞生物学”48・4（2003年）。

Kawano, T.: "Ce-Y14 and MAG-1, components of the exon-exon junction complex, are required for embryogenesis and germline sexual switching in C.elegans"Mechanism of Development. 1211・1. 27-35 (2004)

Kawano, T.：“Ce-Y14 和 MAG-1，外显子-外显子连接复合体的组成部分，是秀丽隐杆线虫胚胎发生和种系性别转换所必需的”发育机制 1211・1 (2004)。

Kataoka, N.: "A simple whole-cell lysate system for in vitro splicing reveals a stepwise-assembly of the exon-exon junction complex."Journal of Biglogical Chemistry. 279・8. 7009-7013 (2004)

Kataoka, N.：“用于体外剪接的简单全细胞裂解物系统揭示了外显子-外显子连接复合物的逐步组装。”《大逻辑化学杂志》279·8 (2004)。

片岡直行: "疾病とRNA"わかる実験医学シリーズ・RNAがわかる. 92-100 (2003)

Naoyuki Kataoka：“疾病与 RNA”实验医学系列/理解 RNA 92-100 (2003)。