核内におけるイントロン分解とスプライシング因子のリサイクル機構の解明

阐明细胞核内含子降解和剪接因子回收机制

• 批准号: 17026021
• 负责人: 片岡 直行
• 金额: $ 3.46万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17026021/
• 关键词: mRNAスプライシング; イントロン; エクソン; 脱ブランチ反応; U snRNP; RNAスプライシング; ラリアット構造

高等真核生物の核にコードされる遺伝子の多くは、介在配列であるイントロンによって分断化されている。このため、核内で合成されたmlmA前駆体が、細胞質で蛋白質合成の鋳型として機能するためには、イントロンを取り除きエクソン同士を連結するmRNAスプライシングが必須となる。スプライシングにより切り出されたイントロンは核内にとどまり、スプライシング因子が除去された後分解されると考えられている。ヒトではイントロンはmRNA前駆体の実に95%を占めている。またsnoRNAやmicroRNAなどの機能的non coding RNAがイントロン上にコードされていることからも、イントロンの代謝は高等真核生物では重要な過程だと考えられる。しかし、その経路はほとんど明らかにされていない。本研究では、核内でのイントロンの代謝とスプライシング因子のリサイクル機構の解明を目的としている。イントロン代謝経路や、そこに関わる因子群を解析するため、in vitroスプライシング系を用いた精製系を開発し、イントロンータンパク質複合体を単離した。その結果、イントロン複合体中にはU2,U5,U6 snRNAが存在することがわかった。さらにこの複合体をグリセロール密度勾配遠心法により分画すると、沈降係数が大きいもの(L)と小さいもの(S)に分けられることがわかった。そして前述の3種類のU snRNPはLに存在し、Sにはほとんどないこと、さらにSに存在するラリアット型イントロンは脱ブランチ反応を受けやすいが、Lのものはほとんど受けないことがわかり、イントロンはスブライシング後にL、Sという二つの過程を経て分解されていくことがわかった。またイントロン複合体に存在する蛋白質因子群の同定を行い、いくつかのタンパク質を同定した。そしてそれらがラリアット型イントロンと結合していることをin vitroスプライシング反応系を用いて確認した。

较高真核生物核中编码的许多基因都被中间序列内含子碎片。因此，为了使细胞核中合成的MLMA前体作为细胞质中蛋白质合成的模板的作用，mRNA剪接将其去除内含子和链接在一起，这是必不可少的。据信，通过剪接切除的内含子保留在细胞核中，并在去除剪接因子后会退化。在人类中，内含子占mRNA前体的95％。此外，由于在内含子上编码了功能性的非编码RNA（例如SNORNA和microRNA），因此内含子代谢被认为是较高的真核生物中的重要过程。但是，这条路线在很大程度上未知。这项研究旨在阐明核中内含子的代谢以及剪接因子的回收机制。为了分析内含子代谢途径和其中所涉及的因素，开发了使用体外剪接系统的纯化系统来隔离内含子蛋白质复合物。结果，发现内含子复合物中存在U2，U5和U6 SNRNA。此外，发现该复合物是通过甘油密度梯度离心分离的，以分为具有较大沉积系数（L）的甘油密度梯度，并且具有较小的沉积系数（S）。发现以上三种类型的u snRNP存在于L中，很少存在于S中，并且S中存在的套外型内含子容易受到分支反应的影响，但是L几乎不会影响它们，并且内含子在通过两个过程中分解后分解了两个过程：L和S。另外，蛋白质因素中存在的蛋白质因子中存在于内含蛋白中，并鉴定出了几个蛋白质。然后使用体外剪接反应系统确认它们与肾型内含子结合。