進行停止時におけるDNA複製フォークの分子構造

过程停滞期间 DNA 复制叉的分子结构

基本信息

批准号：
15023235
负责人：
中川拓郎
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA傷害や染色対高次構造など様々な要因により、DNA複製は阻害される。この時、チェックポイント機構などにより、進行途中で停止した複製中間体(複製フォーク)が安定維持される。その結果、ゲノム安定性が保持され、細胞死や癌化が防御される。我々は、複製フォーク上に存在するPNAヘリケース、MCM、が複製フォークの安定化に関与するのではないかと考え、分裂酵母MCM4、MCM6遺伝子の変異株のスクリーニングを行った。その結果、複製阻害剤(ヒドロキシウレア(HU)、メチルメタンスルホン酸)に高感受性を示す新規mcm4、mcm6変異株の単離に成功した。変異部位が共に、ロイシンジッパーを呈するC末領域に存在することから、蛋白間相互作用に欠損を持つ可能性が考えられる。単鎖DPNA結合蛋白RPA、PI3関連キナーゼRAD3、PCNA様チェックポイント因子RAD9蛋白の進行停止時に見られる複製フオークへの局在を解析した結果、mcm4変異株ではRAD9の局在の特異的な遅延が見られた。また、DNAダメージチェックポイントキナーゼCHK1のリン酸化は見られる一方、S期チェックポイントキナーゼCDS1/CHK2の活性化がほとんど見られなかった。これらの結果から、MCMヘリケースは、RAD9蛋白の複製フォークの認識を制御することで、S期チェックポイント活性化を誘導する可能性が考えられる。

DNA 复制可能受到多种因素的抑制，包括 DNA 损伤和染色与构象的关系。此时，检查点机制等稳定地维护在过程中停止的复制中间体（复制叉）。结果，基因组稳定性得到维持，细胞死亡和癌变得到预防。我们假设复制叉上存在的 PNA 解旋酶 MCM 可能参与稳定复制叉，并筛选了裂殖酵母 MCM4 和 MCM6 基因的突变株。结果，我们成功分离出对复制抑制剂（羟基脲（HU）和甲基甲磺酸）高度敏感的新型mcm4和mcm6突变株。由于两个突变位点均位于具有亮氨酸拉链的 C 末端区域，因此蛋白质-蛋白质相互作用可能存在缺陷。对进展停滞期间观察到的单链 DPNA 结合蛋白 RPA、PI3 相关激酶 RAD3 和 PCNA 样检查点因子 RAD9 蛋白在复制叉上的定位进行分析表明，RAD9 的定位存在特定的延迟在 mcm4 突变体中可以看到。此外，虽然观察到 DNA 损伤检查点激酶 CHK1 的磷酸化，但几乎没有观察到 S 期检查点激酶 CDS1/CHK2 的激活。这些结果表明MCM解旋酶可能通过控制复制叉处RAD9蛋白的识别来诱导S期检查点激活。