マラリア・アピコプラストのレドックス蛋白質群の探索と機能の解明

寻找疟疾顶端质体中的氧化还原蛋白并阐明其功能

基本信息

批准号：
15019055
负责人：
長谷俊治
金额：
$ 3.07万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)マラリアFdの酸化還元電位を測定した。このFdは-220mV程度であり植物Fdの電位(-420〜-350mV)に比べ非常に高く、-340mVの電位をもつNADPHからの電子移動が熱力学的に起こりやすいことがわかった。また、結晶構造を基に、[2Fe-2S]クラスター近傍の部位特異的改変体を作製に、電位を規定している構造要因の解析を行った。2)マラリアゲノムに存在するFNR遺伝子を化学合成し、大腸菌発現系で組換え酵素として精製する方法を確立し、抗体も作製した。マラリアFdとの酵素反応と複合体形成を速度論的解析やアフィニティー樹脂との結合実験から、マラリアFdとFNRの相互作用の詳細を明らかにした。3)このマラリアFdとFNRは、電子伝達複合体を形成してNADPHからの電子を種々の化合物に伝達する機能をもつ。この複合体から効率良く電子を受容し、しかもラジカル種のような細胞毒性を発揮できる薬剤をin vivoアッセイ系でスクリーニングした。この薬剤の効果を熱帯熱マラリア原虫のヒト赤血球の培養系を用いて評価した所、上記アッセイ系での結果とよく対応した。これらの薬剤を用いて、大阪大学微生物病研究所の堀井教授との共同でマウスを用いた個体実験を行っている。4)マラリア原虫のゲノム情報を精査すると、植物のヘムオキシゲナーゼと相同な読み粋が存在することが判明した。シアノバクテリア由来のヘムオキシゲナーゼを比較解析のために調製し、NADPH/FNR/Fdに依存したin vitro活性の測定系を作製した。マラリアヘムオキシゲナーゼについては、遺伝子全化学合成による大腸組換え蛋白質の発現を試み部分精製している。上記のFdレドックスカスケードに依存した活性を検出できる段階に至っている。

1）测量疟疾FD的氧化还原潜力。该FD约为-220mV，与植物FD（-420至-350mv）的电势相比，该FD非常高，发现从NADPH的电子转移-340MV为-340MV是热力学的。此外，基于晶体结构，分析了定义电势的结构因子，以制备[2FE-2S]簇附近的位点特异性变体。 2）建立了一种方法来化学合成存在于疟疾基因组中的FNR基因，并将其纯化为大肠杆菌表达系统中的重组酶，还产生了抗体。对疟疾FD的酶反应和复杂形成的动力学分析以及与亲和力树脂的结合实验揭示了疟疾FD和FNR之间相互作用的细节。 3）疟疾FD和FNR具有形成电子传递复合物以将电子从NADPH传递到各种化合物的功能。使用体内测定系统筛选有效地接受这种复合物并可以发挥细胞毒性（例如自由基物种）的电子。使用恶性疟原虫的人类红细胞培养系统评估了该试剂的效果，并与上述测定系统中的结果密切相匹配。使用这些药物，我们一直在使用小鼠与大阪大学微生物疾病研究所的Horii合作进行单个实验。 4）对疟原虫寄生虫的基因组信息的仔细检查表明，植物血红素氧酶有同源读数。为比较分析准备了蓝细菌衍生的血红素氧化酶，以创建一种用于测量基于NADPH/FNR/FD的体外活性的系统。疟疾血红素氧酶已被部分纯化，以试图通过总基因化学合成来表达结肠重组蛋白。已达到上述FD氧化还原依赖性活性以检测到。