有用アルカロイド生産性オウレン細胞のEST解析

产生有用生物碱的 Ouren 细胞的 EST 分析

• 批准号: 15011225
• 负责人: 佐藤 文彦
• 金额: $ 3.07万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011225/
• 关键词: イソキノリンアルカロイド; 生合成遺伝子; 転写因子; EST解析; オウレン培養細胞; アルカロイド生産性; 遺伝子機能解析

イソキノリンアルカロイドは、植物アルカロイドの中でも最も大きな一群を構成しており、モルヒネやベルベリンなど、多様な生理活性を有する重要なアルカロイドである。同アルカロイド生合成系は、植物二次代謝系の中でも分子レベルでの解明が進んでいるものの1つであるが、未だ、その全容の解明には至っていない。これまでの個別の生合成酵素の単離・同定ではなく、網羅的に生合成関連遺伝子群を単離・同定することを目的に、これまでに我々が細胞選抜により確立したベルベリン高生産オウレン培養細胞において発現している遺伝子(EST)の配列決定を行なった。予備的に、約1000のEST配列を決定し、我々が従来法で決定してきた生合成酵素遺伝子の多くが、複数個(全体の数%相当)含まれていることを認めてきたが、今回、さらに約4000のEST配列を決定し、すくなくとも、これまでに単離した生合成遺伝子の全てが複数含まれることを認めた。従って、ほぼ十分な数のESTの配列決定ができたと考えられた。現在、得られたEST配列情報を元に機能解析を進めており、多くの転写因子候補遺伝子配列が含まれていることを認めた。一方、遺伝子機能を推定するために、異なるアルカロイド生産性を示す細胞株を用いた発現解析を行ない、アルカロイド生合成能と相関性をもつと考えられる遺伝子の絞り込みを行なった。さらに、絞り込んだ遺伝子の機能を、大腸菌において発現した組み換えタンパク質を用いて解析した。その結果、未同定の酵素反応に対する遺伝子の同定にも成功し、これら手法の有望が確かめられたと考えている。次年度以降は、さらに、現在開発中の一過的RNAiによる簡便な遺伝子機能同定法を用いて、遺伝子機能の同定をすすめたいと考えている。

异喹啉类生物碱是植物生物碱中最大的一类，是具有多种生理活性的重要生物碱，如吗啡、小檗碱等。生物碱生物合成系统是植物次生代谢系统之一，在分子水平上已被充分了解，但其全部细节尚未阐明。为了全面分离和鉴定一组生物合成相关基因，而不是常规分离和鉴定单个生物合成酶，我们通过对表达的基因（EST）进行测序，建立了高产小檗碱的Aurean培养物。细胞进行了。我们初步确定了大约1000个EST序列，发现我们之前确定的生物合成酶基因中有很多都含有多个基因（相当于总数的百分之几），而且他们还确定了大约4000个EST序列，发现它们至少含有多个基因。迄今为止分离出的所有生物合成基因。因此，认为已经对足够数量的EST进行了测序。目前我们正在根据获得的EST序列信息进行功能分析，发现其中含有很多转录因子候选基因序列。另一方面，为了估计基因功能，我们使用显示不同生物碱生产力的细胞系进行表达分析，并缩小了被认为与生物碱生物合成能力相关的基因的范围。此外，使用大肠杆菌中表达的重组蛋白分析了所选基因的功能。结果，我们成功地鉴定了未知酶反应的基因，并且我们相信这些方法的前景已经得到证实。从明年开始，我们希望通过使用瞬时RNAi的简单基因功能识别方法进一步识别基因功能，目前该方法正在开发中。

项目成果

F.Sato(Chapter author) eds, Bhojwani, S.S., Soh, W-Y.: "Agrobiotechnology and Plant Tissue Culture"Science Pub.Inc., New Hampshiere, USA. 97-104(197) (2003)

F.Sato（章节作者）编辑，Bhojwani, S.S., Soh, W-Y.：“农业生物技术和植物组织培养”Science Pub.Inc.，新罕布什尔州，美国。