ラボCDベース1細胞アッセイ用ハイスループットスクリーニングシステム

用于实验室基于 CD 的单细胞测定的高通量筛选系统

基本信息

批准号：
19021045
负责人：
久保いづみ
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Soka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

ラボCDはマイクロ流路をシリコン基板に反応性イオンエッチング(Deep-RIE)により形成させて作製した。流路はディスクの中心から外側に向けてジグザグ形に作成した。一枚のディスク上に24本の流路があり、一本の流路に313個のμチャンバーが付いている。チャンバーのサイズは300μm×200μm×46μmのU字型である。チャンバー一つあたりに分離される溶液の体積は約1.5nlである。このラボCDのインレット部分にPCR試薬とサルモネラ菌の混合溶液を1μl入れ、5000rpmで30秒間回転させる事によって細胞単離を行った。その後、連続的にthermal cyclerを用いて95℃で2分の溶菌、続けて95℃で5秒、55℃で10秒、72℃で10秒のサイクルで反応させる事によってPCRを行い、サルモネラ菌固有遺伝子であるinvA遺伝子を増幅し、イメージングアナライザーで蛍光強度を確認した。細胞一個からのPCRが可能か調べるために、PCR試薬中に400cells/μlの濃度でサルモネラ菌を入れ、細胞単離を行った後、溶菌し、PCRを行い、その蛍光強度を確認してみた。その結果、ボアソン分布に依存した細胞数に従った蛍光強度の分布を確認する事ができた。Table1には、それぞれの濃度でのボアソン分布による各μチャンバーに入る細胞の数の確率を示した。このことから、細胞数に応じた蛍光強度になる事が確認された。また、今後の研究においては蛍光強度が2500を越えたものをポジティブとすることに決めた。さらに、大腸菌とサルモネラ菌を100cells/μlの濃度でPCR試薬中に入れたものでもPCRを行った。その結果、200cells/μlのサルモネラ菌のみを入れたPCR試薬の結果よりも、少ない細胞数が確認された。200cells/μlの大腸菌のみを入れたものでは全く蛍光強度が上がらなかったため、大腸菌とサルモネラ菌との間でサルモネラ菌に対しての選択性が確認された。

Lab CD 是通过反应离子蚀刻 (Deep-RIE) 在硅基板上形成微通道来制造的。流路从圆盘中心向外形成锯齿形。一张圆盘上有24个通道，每个通道有313μ室。腔室的尺寸为U形，尺寸为300μm x 200μm x 46μm。每个室分离的溶液体积约为 1.5 nl。将1μl PCR试剂和沙门氏菌的混合溶液放入该实验室CD的入口中并以5000rpm旋转30秒来进行细胞分离。然后，使用热循环仪，通过在95℃下连续裂解细菌2分钟，然后在95℃下反应5秒、55℃下反应10秒和72℃下反应10秒来进行PCR。扩增基因并使用成像分析仪确认荧光强度。为了研究是否可以从单细胞进行PCR，将沙门氏菌以400个细胞/μl的浓度添加到PCR试剂中，分离细胞，裂解细胞，进行PCR，并确认荧光强度。结果，我们能够根据取决于布瓦松分布的细胞数量来确认荧光强度的分布。表1显示了根据每个浓度下的布瓦松分布进入每个μ室的细胞数量的概率。由此确认荧光强度根据细胞数而变化。此外，在未来的研究中，确定荧光强度超过2500将被视为阳性。此外，还使用含有浓度为100个细胞/μl的大肠杆菌和肠沙门氏菌的PCR试剂进行PCR。结果，确认了细胞数低于仅含有200个细胞/μl沙门氏菌的PCR试剂的结果。由于仅添加200个细胞/μl的大肠杆菌时荧光强度完全没有增加，因此确认了大肠杆菌和沙门氏菌之间对沙门氏菌的选择性。