酵母細胞における低分子量G蛋白質の時間、空間的制御機構の解明

阐明酵母细胞中低分子量G蛋白的时空控制机制

基本信息

批准号：
18057025
负责人：
黒川量雄
金额：
$ 3.97万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18057025/
关键词：
小胞輪送 FRET Ypt GTPaseフアミリー小胞輸送 Yptファミリー Arfファミリー

项目摘要

分子スイッチであるG蛋白質が細胞機能発現に特異性と多様性をもたらす機構を解明するには、スイッチのオン、オフが細胞内の「いつ、どこで」起きるかを明らかにすることが必要である。本研究では、生細胞内蛋白質の活性変化に伴う構造変化や蛋白質間相互作用の解析に有効な研究手法であるFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の原理を利用して、酵母の蛋白質輸送経路で働く低分子量G蛋白質の時間・空間的相互作用を可視化することを目的としている。本年度は、2分子FRETの系を用いてYptファミリーの一員であるYpt31pとその標的分子であるSec2pとの相互作用を詳細に解析し、さらに酵母変異体を用いてこれらの相互作用がどのように他のYpt(Sec4p)活性化を空間的に制御しているかを調べた。Ypt31pとSec2pにそれぞれYFPとCFPを融合させ、これらの細胞周期の進行に伴った相互作用を可視化した。monomericVenus-Ypt31pとmonomericCFP-Sec2pは芽の先端の及び娘細胞内で共局在するが、FRETシグナルは芽の先端でのみ強く観察された。分裂時には分裂隔壁でFRETシグナルが観察された。この結果から、芽の先端及び分裂隔壁でのみYpt31pとSec2pが相互作用することが明らかになった。つぎに制限温度下でYpt31p/32pの機能阻害が起きる株を用いて、Ypt31p/32pのSec2p、Sec4pの細胞内局在への働きを調べた結果、Ypt31p/32pの機能を阻害するとSec2pとSec4pの芽先端の集積が阻害された。このとき、Sec4pの娘細胞への輸送自体は阻害されなかったことからYpt31p/32pが芽の先端でSec4pの局在化に関与することを明らかにした。

为了阐明G蛋白（分子开关）在细胞功能表达中带来特异性和多样性的机制，有必要弄清楚开关在细胞中何时何地打开和关闭。在这项研究中，我们利用FRET（荧光共振能量转移）的原理来研究活细胞中蛋白质活性变化和蛋白质-蛋白质相互作用相关的结构变化，这是一种有效的研究方法。可视化低分子量 G 蛋白的时间和空间相互作用。今年，我们将使用双分子 FRET 系统详细分析 Ypt 家族成员 Ypt31p 与其目标分子 Sec2p 之间的相互作用，并利用酵母突变体进一步研究这些相互作用是如何发生的，我们研究了它是否在空间上控制。激活其他Ypt（Sec4p）。我们分别将 YFP 和 CFP 与 Ypt31p 和 Sec2p 融合，并可视化它们在细胞周期进展过程中的相互作用。尽管单体Venus-Ypt31p和单体CFP-Sec2p共定位在芽尖和子细胞内，但仅在芽尖观察到强FRET信号。在分裂期间，在分裂隔膜处观察到FRET信号。这些结果表明，Ypt31p 和 Sec2p 仅在芽尖和分裂隔膜处相互作用。接下来，我们使用在限制性温度条件下Ypt31p/32p的功能被抑制的菌株研究了Ypt31p/32p对Sec2p和Sec4p的细胞内定位的影响。此时，Sec4p向子细胞本身的转运并未受到抑制，表明Ypt31p/32p参与了Sec4p在芽尖的定位。