開口放出で働く繋留因子Exocyst複合体の立体構造解析

在胞吐作用中发挥作用的束缚因子 Exocyst 复合物的三维结构分析

• 批准号: 18054009
• 负责人: 深井 周也
• 金额: $ 4.03万
• 依托单位: The University of Tokyo (2007)Tokyo Institute of Technology (2006)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18054009/
• 关键词: X線結晶構造解析; 電子顕微鏡; 超分子複合体; 小胞輸送; 低分子量GTPase; 開口放出; 膜融合

生体試料から調製したExocyst複合体やサブ複合体はサブユニット構成が不明であり、現段階では単粒子解析による立体像の決定は難しい。しかし、組み換えタンパク質を用いて再構成した複合体の像との比較によって、生体試料から得られた像の解釈が可能になると考えられる。バキュロウイルスの発現系を用いて複合体の再構成を行うべく、組み換えベクターの構築を進めた。今年度は、ラットの4つのサブユニット、ショウジョウバエの7つのサブユニットをバクミド組換え用のベクターに組込み終えた。Exocystの構造解析を進めると共に、研究分担者の京大医・堀内久徳講師との共同研究によりExocyst複合体とRalとの相互作用が血小板の顆粒放出を制御していることを新たに示した。また、Ralの新規結合タンパク質の同定・解析も進めた。出芽酵母のExocyst複合体は、Sec15pサブユニットを介して、酵母のRab GTPase Sec4pとその活性化タンパク質であるグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)Sec2pと相互作用する。我々は、まず、Sec2pのGEFドメインの結晶構造を3.0Å分解能で決定し、GEF反応が180Åの長さの単純なコイルドコイル構造によって行われることを明らかにした。さらに、欠失変異体や点変異体を使った結合アッセイおよびGEFアッセイにより、Sec4p結合サイトと結合に必要なアミノ酸残基を特定した。GEFドメイン単独の結晶構造と生化学的解析の結果に基づいて発現系を設計し、Sec2pのGEFドメインとSec4pの複合体の結晶構造を2.7Å分解能で決定し、ヌクレオチドの解離を促進させるSec4pのスイッチ領域の大きな構造変化が複合体形成によって引き起こされる仕組みを原子分解能レベルで明らかにした。

由生物样品制备的Exocyst复合物和子复合物的亚基组成未知，现阶段很难通过单粒子分析确定三维图像。然而，与使用重组蛋白重建的复合物的图像进行比较可以解释从生物样品获得的图像。我们继续构建重组载体，以使用杆状病毒表达系统重建复合物。今年，我们完成了将四个大鼠亚基和七个果蝇亚基整合到杆粒重组载体中。除了继续进行 Exocyst 的结构分析外，我们还通过与京都大学医师讲师 Hisanori Horiuchi 的联合研究证明，Exocyst 复合物和 Ral 之间的相互作用控制血小板颗粒的释放。我们还对 Ral 的新型结合蛋白进行了鉴定和分析。酿酒酵母胞囊复合体通过 Sec15p 亚基与酵母 Rab GTPase Sec4p 及其激活蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) Sec2p 相互作用。我们首先以 3.0 Å 分辨率测定了 Sec2p GEF 域的晶体结构，并揭示了 GEF 反应是通过长度为 180 Å 的简单卷曲螺旋结构进行的。此外，我们使用缺失突变体和点突变体的结合测定以及GEF测定鉴定了Sec4p结合位点和结合所需的氨基酸残基。我们仅根据GEF结构域的晶体结构和生化分析的结果设计了表达系统，并以2.7 Å的分辨率确定了Sec2p和Sec4p的GEF结构域复合物的晶体结构。复杂的形成导致开关区域的结构变化有多大。

项目成果

Structural basis of RNA-dependent recruitment of glutamine to the genetic code

• DOI: 10.1126/science.1128470
• 发表时间: 2006-06-30
• 期刊: SCIENCE
• 影响因子: 56.9
• 作者: Oshikane, Hiroyuki;Sheppard, Kelly;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu

Regulation of platelet dense granule secretion by the Ral GTPase-Exocyst pathway

Ral GTPase-Exocyst 通路对血小板致密颗粒分泌的调节

• 发表时间: 2008
• 期刊: J.Biol.Chem. 283
• 作者: M.kawato;R.Shirakawa;H.Kondo;T.Higashi;T.Ikeda;K.Okawa;S.Fukai;O.Nureki;T.Kita;H.Horiuchi
• 通讯作者: H.Horiuchi

Rhoによって制御される細胞質中のForminタンパク質によるアクチン重合

由 Rho 控制的细胞质中的 Formin 蛋白进行肌动蛋白聚合

• 发表时间: 2007
• 作者: 東 智仁;ほか
• 通讯作者: ほか

Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction of SecDF, a translocon-associated membrane protein, from Thermus thermophilus

• DOI: 10.1107/s1744309106007779
• 发表时间: 2006-04-01
• 期刊: ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION F-STRUCTURAL BIOLOGY COMMUNICATIONS
• 影响因子: 0.9
• 作者: Tsukazaki, T;Mori, H;Ito, K
• 通讯作者: Ito, K

Crystal structure of human DAAM1 formin homology 2 domain

• DOI: 10.1111/j.1365-2443.2007.01132.x
• 发表时间: 2007-11
• 期刊: Genes to Cells
• 影响因子: 2.1
• 作者: M. Yamashita;T. Higashi;S. Suetsugu;Yusuke Sato;Tomoyuki Ikeda;R. Shirakawa;T. Kita;T. Takenawa;H. Horiuchi;S. Fukai;O. Nureki