繋留因子群の立体構造解析による膜融合制御機構の解明

通过束缚因子的三维结构分析阐明膜融合控制机制

基本信息

批准号：
16044214
负责人：
深井周也
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

オルガネラ間の物質輸送は小胞を介して行われる.目的の部位に到達した小胞は,標的膜と融合することによって積荷を受け渡す.繋留因子は,膜融合の初期段階で,小胞とその標的膜とを特異的に繋留することによって輸送の特異性を保証する.繋留因子は,3-8個のサブユニットから構成されるタンパク質複合体であり,低分子量GTPaseとの相互作用によってヌクレオチド依存的に制御されている.本研究では,開口放出で働くExocyst複合体の立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡によって決定し,繋留の物理的機構とその制御機構を明らかにする.さらに,変異体をつかって細胞レベル,in vitroでの解析を行い,機能の面からの裏付けを行う.今年度は,ほ乳類のExocyst複合体の電子顕微鏡による解析と,酵母のExocyst複合体と結合するSec4のGEFであるSec2のX線結晶構造解析を行なった.Exocyst複合体は,ブタ脳あるいはラット脳から精製し,電子顕微鏡をつかって,酢酸ウラニルによる負染色像を観察した.当初は,粒子の均一性に問題があったが,調製方法を改善することにより,Exocyst複合体全体と考えられる約150Åの大きさの粒子を多く観察できるようになった.しかしながら,解離した複合体と考えられる約60Åと120Åの大きさの粒子が依然として残っており,解析の妨げとなっている.粒子の均一性を高めることにより,単粒子解析が可能な試料調製法を確立することが,今後の課題である.また,Exocyst複合体と相互作用するRalのGTPase活性化タンパク質を新規に同定した.in vitroでの活性測定を終え,現在は,細胞レベルでの解析を行なっている.一方,Sec2については,Sec4との相互作用領域の結晶構造を3.0Å分解能で決定した.Sec2のSec4結合領域は,200Åの長さをもつトロポミオシン様のcoiled coilを形成していた.現在,立体構造にもとついてin vitroでの機能解析を進めている.

细胞器之间的物质运输是通过囊泡进行的。到达目标位点的囊泡通过与目标膜融合来转移货物。在膜融合的初始阶段，束缚因子与囊泡相互作用。通过将其特异性束缚于囊泡，确保了运输的特异性。目标膜是由 3 至 8 个亚基组成的蛋白质复合物。在本研究中，我们通过X射线晶体学或电子显微镜确定了在胞吐作用中发挥作用的Exocyst复合体的三维结构，并研究了其束缚的物理机制及其控制机制。此外，我们将使用突变体。为了研究细胞水平，我们将进行体外分析来支持该功能。今年，我们将对哺乳动物 Exocyst 复合物进行电子显微镜分析，并对 Sec2（与酵母 Exocyst 复合物结合的 Sec4 的 GEF）进行 X 射线结晶。从猪脑或大鼠脑中纯化Exocyst复合物，并使用电子显微镜观察乙酸双氧铀负染色图像，最初，颗粒的均匀性存在问题，但通过改进制备方法，E。可以观察到许多尺寸约为 150 Å 的颗粒，这些颗粒被认为是整个 xocyst 复合体。然而，尺寸约为 60 Å 和 120 Å 的颗粒（被认为是解离的复合体）仍然存在，这妨碍了隔壁的分析。未来的挑战是建立一种样品制备方法，通过提高颗粒均匀性来实现单颗粒分析。此外，我们将开发一种新的 Ral GTPase 激活蛋白，它与 in.in 中鉴定的 Exocyst 复合物相互作用。完成体外活性测量后，我们目前正在进行细胞水平的分析。另一方面，对于Sec2，我们以3.0 Å的分辨率确定了与Sec4相互作用区域的晶体结构。Sec2的Sec4结合区域它形成了一个类似原肌球蛋白的卷曲线圈，长度为200 Å。目前，我们正在进行基于三维结构的体外功能分析。