膜貫通型膜タンパク質の反応機構解明のための赤外分光法の開発

开发红外光谱阐明跨膜蛋白的反应机制

• 批准号: 17053023
• 负责人: 小倉 尚志
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: University of Hyogo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17053023/
• 关键词: 膜タンパク質; 赤外分光法; 反応機構; 呼吸鎖; 共鳴ラマン; ミトコンドリア; 時間分解; 振動スペクトル

1.新規赤外分光光度計の開発 酵素タンパク質の反応機構を明らかにするためには、活性部位に異方性をもって配置されたアミノ酸の反応性の違いを検出し得るほど高感度の時間分解赤外分光法が必要不可欠である。しかし、どのようなタンパク質にも適用可能な時間分解赤外分光法は開発されていなかった。この目的のために本研究では、赤外マルチチャンネル検出器と流路が200μm×200μmのCaF_2製フローセルを組み合わせ、赤外白色レーザー光を光源とする新規赤外分光光度計を設計した。まず、グローバー光源を用いて、一酸化炭素結合型チトクロムc酸化酵素を測定したところ、νc-o由来の吸収帯の検出に成功した。次に一酸化炭素結合型酵素の光乖離と再結合のダイナミクスの追跡に挑戦し、Δt=0、20、40msの時間分解赤外吸収スペクトルの測定に成功した。したがって、フローセルを用いて酵素の構造ダイナミクスを測定できる新規装置が稼働した。より高精度のスペクトルを得るための光源である赤外白色レーザーは、現在、最終調整を行っており、一ヶ月以内に終わる予定である。2.ミトコンドリア中のチトクロムc酸化酵素による酸素活性化反応の追跡 ミトコンドリア中のチトクロムc酸化酵素の時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素化型、P型およびF型反応中間体に由来するν<Fe>-o振動モードの観測に成功した。これらの振動数は、可溶化酵素の、対応する反応中間体の振動数と一致した。一方、酸素化型反応中間体は、ミトコンドリア中では反応開始後1.4msでも観測されたが、可溶化状態では0.5ms程度で消失することが知られていた。このことは、ミトコンドリア内膜系がチトクロムc酸化酵素の反応中間体の寿命に影響を与えていることを意味するが、そのしくみを調べることが次の課題である。

1.新型红外分光光度计的开发为了阐明酶蛋白的反应机理，需要高灵敏度的时间分辨红外分光光度计来检测活性位点各向异性排列的氨基酸的反应性差异，外部光谱学是必不可少的。然而，可应用于任何蛋白质的时间分辨红外光谱尚未开发出来。为此，本研究设计了一种新型红外分光光度计，该分光光度计采用红外白光激​​光作为光源，将红外多通道探测器与流路为200 μm x 200 μm的CaF_2流通池相结合。首先，当我们使用glober光源测量一氧化碳结合的细胞色素c氧化酶时，我们成功地检测到源自νc-o的吸收带。接下来，我们尝试跟踪一氧化碳结合酶的光学解离和重组动力学，并成功测量了 Δt=0、20 和 40 ms 时的时间分辨红外吸收光谱。因此，一种可以使用流动池测量酶结构动力学的新装置投入运行。红外白光激​​光器是用于获得更准确光谱的光源，目前正在进行最后的调整，预计将在一个月内完成。 2.线粒体中细胞色素c氧化酶追踪氧活化反应我们测量了线粒体中细胞色素c氧化酶的时间分辨共振拉曼光谱。我们成功地观察到源自含氧、P 型和 F 型反应中间体的 ν<Fe>-o 振动模式。这些频率与溶解酶的相应反应中间体的频率相匹配。另一方面，在反应开始后1.4ms后，在线粒体中也观察到含氧反应中间体，但已知它们在约0.5ms后以溶解状态消失。这意味着线粒体内膜系统影响细胞色素c氧化酶反应中间体的寿命，下一个挑战是研究这一机制。