培養神経細胞でプリオン蛋白質による発現制御される遺伝子群のマイクロアレイ解析

培养神经元中表达受朊病毒蛋白调节的基因的微阵列分析

基本信息

批准号：
16017320
负责人：
佐藤準一
金额：
$ 4.48万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

目的・方法:プリオン病では正常型プリオン蛋白質PrPCがcavolae-like domain(CLD)で未知のspecies-specific molecular chaperone Protein Xを介して異常型プリオン蛋白質PrPSCに構造変換される。本研究ではPrPSCによる神経細胞死誘導機序を解明するため、PrPC異常蓄積がCLDシグナル伝達系に対して障壁を形成し、下流遺伝子群発現異常を惹起するとの仮説を考案し、検証するため(1)平成16年度はPrP遺伝子恒常的高発現培養細胞の遺伝子発現プロフィールをcDNA microarrayで解析し、(2)平成17年度はヒト神経細胞のプロテオーム解析(2D-PAGE, protein overlay, mass Spectrometry, protein microarray)によりProtein X候補を探索した。結果:(1)PrPC恒常的高発現により神経変性関連遺伝子SCA12責任遺伝子PPP2R2BとPCDターゲット遺伝子CDR34の発現上昇を認めた。(2)培養ヒト神経細胞におけるPrPC結合蛋白質として14-3-3,アストロサイトの14-3-3結合蛋白質としてvimentinを同定した。14-3-3はisoform- or cell type-nonspecific, phosphorylation-independentにHsp60と結合した。Protein microarray解析により14-3-3結合蛋白質としてEAP30,DDX54,STACを同定した。考察・結論:(1)プリオン蛋白質蓄積が遺伝子発現制御異常を介して神経細胞死を惹起し得る。(2)ヒト中枢神経系で生理的条件下14-3-3,PrPC,Hsp60はtrimolecular complexを形成し、プリオン病脳ではPrPCがPrPSCに構造変換・凝集される過程で、14-3-3はcomplexから離脱し、degenerating neuronから髄液中に放出される。網羅的トランスクリムトーム・プロテオーム解析により、ヒト培養細胞におけるPrPC誘導遺伝子や結合蛋白質を同定し得た。これらはクロイツフェルトヤコブ病の診断キットや創薬ターゲットとなりうる。

目的/方法：在朊病毒疾病中，正常朊病毒蛋白PrPC通过cavolae样结构域（CLD）中的未知物种特异性分子伴侣蛋白X在结构上转化为异常朊病毒蛋白PrPSC。在本研究中，为了阐明PrPSC诱导神经元细胞死亡的机制，我们提出并验证了异常的PrPC积累对CLD信号转导系统形成障碍并诱导下游基因异常表达的假设（1）2004财年，我们使用 cDNA 微阵列分析了 PrP 基因组成型高表达的培养细胞的基因表达谱，并且（2）在 2005 财年，我们分析了人类神经元的蛋白质组（2D-PAGE、蛋白质覆盖、质量我们使用光谱测定法、蛋白质微阵列来寻找蛋白质 X 候选物。结果：（1）PrPC的持续高表达增加了神经变性相关基因SCA12责任基因PPP2R2B和PCD靶基因CDR34的表达。 (2)在培养的人神经元中，14-3-3被鉴定为PrPC结合蛋白，而波形蛋白在星形胶质细胞中被鉴定为14-3-3结合蛋白。 14-3-3 以异构体或细胞类型非特异性、磷酸化独立的方式与 Hsp60 结合。通过蛋白质微阵列分析，EAP30、DDX54 和 STAC 被鉴定为 14-3-3 结合蛋白。讨论/结论：（1）朊病毒蛋白积累可通过异常基因表达调控诱导神经细胞死亡。 (2)在人体中枢神经系统中，14-3-3、PrPC、Hsp60在生理条件下形成三分子复合物，而在朊病毒病脑中，14-3-3离开复合物并释放到脑脊液中通过退化的神经元。通过全面的转录组和蛋白质组分析，我们能够在人类培养细胞中鉴定 PrPC 诱导的基因和结合蛋白。这些可用作克雅氏病的诊断试剂盒或药物发现靶点。