体細胞突然変異の遺伝子部位特異的な導入機構

基因位点特异性引入体细胞突变的机制

基本信息

批准号：
16017248
负责人：
縣保年
金额：
$ 3.78万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16017248/
关键词：
遺伝子感染症癌発現制御免疫学

项目摘要

1)E2Aによる抗体遺伝子の転写誘導とクロマチン構造変化の解析、および体細胞突然変異導入の試み遺伝子導入効率の高いBOSC23細胞にE2A転写因子を発現させると、E2Aが内在性Igκ遺伝子の可変領域に結合し、ヒストンH3、H4のアセチル化とH3-K4のメチル化の上昇を介して転写を誘導することを見出した。そこでE2AとともにAIDを発現させ、内在性Igκ遺伝子で体細胞突然変異が導入できるか解析したが、変異は導入されなかった。このことから、E2Aの単独発現では転写とヒストンアセチル化の誘導レベルが充分でないことが示唆された。2)E2Aによってリクルートされるヒストンアセチル化酵素の同定そこでE2Aによって動員されるヒストンアセチル化酵素を検索したところ、CBP/p300がE2Aと結合し、さらにE2AによってIgκ遺伝子可変領域にリクルートされることを見いだした。そこで、E2Aと共にCBP/p300を過剰発現させたところH3-K18のアセチル化が特異的に促進され、転写が増強されること、逆にsiRNAによって内在性のCBP/p300をノックダウンするとH3-K18のアセチル化が低下し、転写も低下することを見出した。以上の結果を踏まえて、CBP/p300の過剰発現により転写とヒストンアセチル化の誘導レベルを上昇させた状態でE2AとAIDを共発現させ、内在性抗体遺伝子で体細胞突然変異が誘導されないか、逆に突然変異を誘導できる細胞株でE2AやCBP/p300を低下させ、変異の導入頻度が低下しないか引き続き検討を行なっている。

1) 分析E2A引起的抗体基因转录诱导和染色质结构变化，并尝试引入体细胞突变当E2A转录因子在基因转移效率高的BOSC23细胞中表达时，E2A被转移到内源性可变区我们发现它通过增加组蛋白 H3 和 H4 乙酰化以及 H3-K4 甲基化来结合并诱导转录。因此，我们将AID与E2A一起表达，并分析是否可以将体细胞突变引入内源Igκ基因，但没有引入突变。这表明单独表达 E2A 并不能诱导足够水平的转录和组蛋白乙酰化。 2）E2A招募的组蛋白乙酰转移酶的鉴定我们寻找了E2A招募的组蛋白乙酰转移酶，发现CBP/p300与E2A结合，并进一步被E2A招募到Igκ基因可变区。因此，我们发现CBP/p300与E2A一起的过表达特异性促进H3-K18乙酰化并增强转录，相反，用siRNA敲低内源CBP/p300促进H3-K18乙酰化并增强转录。蛋白质减少，转录也减少。基于以上结果，我们研究了通过共表达E2A和AID是否不会诱导内源抗体基因体细胞突变，同时通过CBP/p300的过度表达来增加转录和组蛋白乙酰化的诱导水平，相反，我们正在继续研究。研究是否可以在可以诱导突变的细胞系中降低 E2A 或 CBP/p300，以减少突变引入的频率。