B細胞の分化初期に発現するZnフィンガー因子の遺伝子単離と解析

B细胞分化早期表达的Zn指因子的遗传分离与分析

基本信息

批准号：
08770086
负责人：
縣保年
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770086/
关键词：
転写因子 Kruppel Znフィンガー B細胞分化 lipopolysaccharide Interleukin-4 RT-PCR Anchored PCR

项目摘要

本研究では、B細胞の分化初期に発現するKruppel型Znフィンガー転写因子の遺伝子を単離・解析することを目的とし、モデル系としてLPSとIL-4で刺激したマウス脾細胞から、保存された配列を標的としたRT-PCR法により効率的に遺伝子単離を行なうシステムの確立を試みた。まず標的配列に対応する混合プライマーに、アンカー配列を付加したAnchored PCRを行ない、、目的とするZnフィンガー遺伝子を特異的かつ効率よく増幅することを可能とし、さらにベクターを改変し挿入する遺伝子とLacZ遺伝子の読み枠を合わせ、目的とする組み換え体をより効率よく選別できるようにした。現在までに65種類のZnフィンガー遺伝子を単離し、そのうち62種は未知であった。次にこれら多くのクローンの中から、特定の分化段階や刺激によって特異的に発現するようなものを選択するために、LPS/IL-4刺激あるいは無刺激のマウス脾細胞から、それぞれ同様にZnフィンガー遺伝子をRT-PCRにより調製したものけプローブとして、刺激した細胞由来の遺伝子ライブラリーをスクリーニングした結果、刺激により有意に発現が増強される遺伝子を単離することができた。この遺伝子は細胞癌化との関連性が示唆されており、機能的に大変興味深い。さらにこの遺伝子を含むいくつかのクローンの全長cDNAを単離したところ、Kruppel型Znフィンガー転写因子のサブファミリーにおいて、転写を抑制あるいは活性化することが示唆されている遺伝子の機能領域と、高い相同性を有する3つの新しい遺伝子が存在することがわかった(論文投稿中)。今後は、B細胞の初期分化をin vitroで誘導できる骨髄細胞あるいは胚性幹細胞培養系のようなきわめて少ない細胞を取り扱う系から、この高感度かつ簡便なZnフィンガー遺伝子の単離および選択システムにより、実際に新しい遺伝子の単離を試みるとともに、本研究で単離した遺伝子の転写に対する調節機能に関しても解析を行なっていく予定である。

在本研究中，我们旨在分离和分析在 B 细胞分化早期表达的 Kruppel 型 Zn 指转录因子的基因，我们尝试建立一个使用序列靶向 RT- 进行有效基因分离的系统。 PCR。首先，进行锚定PCR，通过在目标序列对应的混合引物中添加锚定序列，从而可以特异性、高效地扩增目标Zn指基因，然后修饰载体以插入该基因和LacZ，通过比对读数基因框架，我们能够更有效地选择所需的重组体。迄今为止，我们已分离出65种锌指基因，其中62种是未知的。接下来，从这些许多克隆中，为了选择在特定分化阶段或刺激下特异性表达Zn的克隆，使用通过RT-PCR制备的指基因作为探针，筛选源自刺激细胞的基因文库，结果，我们能够分离出其表达因刺激而显着增强的基因。该基因已被认为与细胞癌变有关，并且具有重要的功能意义。此外，我们分离了几个含有该基因的克隆的全长cDNA，发现它与Kruppel型Zn指转录因子亚家族中抑制或激活转录的基因的功能区具有高度同源性。现已发现有3个新的有性基因（论文目前正在提交）。将来，我们将利用这种高度灵敏且简单的系统，从处理很少细胞的系统中分离和选择锌指基因，例如骨髓细胞或胚胎干细胞培养系统，在这些系统中可以诱导B细胞的早期分化。除了实际尝试分离新基因外，我们还计划分析本研究中分离的基因的转录调控功能。