分子系統解析で絞り込んだ未知機能蛋白質の実験的な機能解析

通过分子系统发育分析缩小功能未知蛋白质的实验功能分析

基本信息

批准号：
16013243
负责人：
横堀伸一
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16013243/
关键词：
分子系統解析古細菌ロイシン生合成系 TCA回路

项目摘要

ロイシン生合成に関わる4種の蛋白質遺伝子(leuA、leuB、leuC、leuD)とその相同蛋白質遺伝子(TCA回路、リジン生合成に関わる蛋白質遺伝子と、BLAST検索等で見出された機能未知蛋白質遺伝子)について、それぞれ分子系統解析を行った。既に機能解析がなされている蛋白質を系統樹上にマップし、系統樹の樹形と機能から、各蛋白質を改めてグルーピングした。いずれの系統樹でも、古細菌(殊にメタン菌)が、ロイシン合成系酵素とTCA回路の酵素との境界領域に位置する場合が多いことが観察された。また、真正細菌や真核生物に比べて、古細菌由来の蛋白質遺伝子のhomolog間の一次配列の差違が小さい傾向にあった。機能未知蛋白質のみで構成されている蛋白質グループに属する蛋白質と、機能の異なる蛋白質グループ同士の境界に系統樹上位置する蛋白質について、好熱性の古細菌(Sulfolobus tokodaii、Aeropyrum pernix、Pyrococcus horikoshii)とメタン産生好熱性古細菌Methanocaldococcus jannaschiiからの遺伝子の取得と、その大腸菌中での発現を試みた。発現を試みた蛋白質の過半数が、不溶性の封入体を作るか、発現しなかった。すなわち、ランダムに古細菌の蛋白質を選び、それらの発現効率を検討すると、2〜3割程度の蛋白質が発現し、可溶性画分に来るという結果であった。現在、封入体となっている蛋白質の可溶化など、蛋白質の発現・精製法について、再検討中である。

对参与亮氨酸生物合成的4个蛋白基因（leuA、leuB、leuC、leuD）及其同源蛋白基因（TCA循环、参与赖氨酸生物合成的蛋白基因、通过BLAST检索发现功能未知的蛋白基因等）进行分子系统发育分析为每个执行。已经进行功能分析的蛋白质被映射到系统发育树上，并且每个蛋白质根据系统发育树的树形状和功能重新分组。在两个系统发育树中，观察到古细菌（特别是甲烷细菌）通常位于亮氨酸合成酶和 TCA 循环酶之间的边界区域。此外，与真细菌和真核生物相比，来自古细菌的蛋白质基因的同源物之间的一级序列差异往往较小。使用嗜热古菌（Sulfolobus tokodaii、Aeropyrum pernix、Pyrococcus horikoshii）和甲烷分析属于仅由未知功能蛋白质组成的蛋白质组的蛋白质以及位于系统发育树上具有不同功能的蛋白质组之间边界的蛋白质。我们试图从嗜热古菌詹氏甲烷球菌中获得一个基因，并在大肠杆菌中表达它。大多数蛋白质试图表达，要么形成不溶性包涵体，要么不表达。也就是说，当我们随机选择古菌蛋白质并检查其表达效率时，我们发现大约20％至30％的蛋白质被表达并在可溶性部分中发现。我们目前正在重新审查蛋白质表达和纯化的方法，包括溶解形成包涵体的蛋白质。