分子系統解析で絞り込んだ未知機能蛋白質の実験的な機能解析

通过分子系统发育分析缩小功能未知蛋白质的实验功能分析

基本信息

批准号：
15013253
负责人：
横堀伸一
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15013253/
关键词：
分子系統解析古細菌ロイシン生合成経路 TCA回路

项目摘要

分岐鎖アミノ酸代謝系のうち、ロイシン生合成に関わる4種の蛋白質遺伝子(leuA、leuB、leuC、leuD)とその相同蛋白質遺伝子(TCA回路、リジン生合成に関わる蛋白質遺伝子と、BLAST検索等で見出された機能未知蛋白質遺伝子)について、それぞれ最尤法と近隣結合法による分子系統解析を行った。既に機能解析がなされている蛋白質を系統樹上にマッピングし、系統樹の樹形と機能から、各蛋白質を改めてグルーピングした。いずれの系統樹でも、古細菌(殊にメタン菌)が、ロイシン合成系酵素とTCA回路の酵素との境界領域に位置する場合が多いことが観察された。また、真正細菌や真核生物に比べて、古細菌由来の蛋白質遺伝子のhomolog間の一次配列の差違が小さい傾向にあり、その機能分化の程度については検討の余地があると考えられた。機能未知蛋白質のみで構成されている蛋白質グループに属する蛋白質と、機能の異なる蛋白質グループ同士の境界に系統樹上位置する蛋白質について、好熱性の古細菌(Sulfolobus tokodaii、Aeropyrum pernix、Pyrococcus horikoshii)からの遺伝子の取得と、その大腸菌中での発現を試みた。発現を試みた蛋白質の過半数が、不溶性の封入体を作るか、発現しなかった。すなわち、ランダムに古細菌の蛋白質を選び、それらの発現効率を検討すると、2〜3割程度の蛋白質が発現し、可溶性画分に来るという結果であった。現在、封入体となっている蛋白質の可溶化など、蛋白質の発現・精製法について、再検討中である。宿主細胞として、大腸菌の他、分裂酵母などについても検討している。また、メタン産生好熱性古細菌Methanocaldococcus jannaschiiについて、同様にleuA,B,C,D蛋白質とそのhomolog蛋白質の発現を試みている。

通过BLAST搜索等方法，在支链氨基酸代谢系统中，发现了4个参与亮氨酸生物合成的蛋白基因（leuA、leuB、leuC、leuD）及其同源蛋白基因（TCA循环、参与赖氨酸生物合成的蛋白基因）。使用最大似然法和邻接法对每个已识别的功能未知的蛋白质基因进行分子系统发育分析。已经进行功能分析的蛋白质被映射到系统发育树上，并且每个蛋白质根据系统发育树的树形状和功能重新分组。在两个系统发育树中，观察到古细菌（特别是甲烷细菌）通常位于亮氨酸合成酶和 TCA 循环酶之间的边界区域。此外，与真细菌和真核生物相比，古细菌来源的蛋白质基因同源物之间的一级序列差异往往较小，并且有研究功能分化程度的空间。我们尝试分析来自嗜热古细菌（Sulfolobus tokodaii、Aeropyrum pernix、Pyrococcus horikoshii）的蛋白质，以找出属于仅由具有未知功能的蛋白质组成的蛋白质组的蛋白质，以及位于系统发育树上具有不同功能的蛋白质组之间边界的蛋白质。获得该基因并在大肠杆菌中表达。大多数蛋白质试图表达，要么形成不溶性包涵体，要么不表达。也就是说，当我们随机选择古菌蛋白质并检查其表达效率时，我们发现大约20％至30％的蛋白质被表达并在可溶性部分中发现。我们目前正在重新审查蛋白质表达和纯化的方法，包括溶解形成包涵体的蛋白质。除了大肠杆菌之外，裂殖酵母和其他宿主细胞也在考虑之中。我们还尝试在产甲烷嗜热古菌詹氏甲烷球菌中表达 leuA、B、C 和 D 蛋白及其同源蛋白。