遺伝子組換え担子菌を用いた内分泌攪乱物質分解システムの構築

利用转基因担子菌构建内分泌干扰物降解系统

基本信息

批准号：
14042230
负责人：
本田与一
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

担子菌類(きのこの仲間)のリグニン分解能力を利用して環境中の内分泌撹乱物質を分解除去する系は、他の生物には見られない多種多様な汚染物質に対して有効な点が特徴である。これは、担子菌の中でも白色腐朽菌類は、一般に菌体外に分泌するラッカーゼやペルオキシダーゼによって初発される連鎖的ラジカル反応によって、高分子リグニンの低分子化を促し、これによって生成する多様な芳香族有機化合物を分解・資化するとされている。このため、白色腐朽菌は多環式・複素環式芳香族化合物や高塩基置換性の芳香族化合物など、バクテリア等では分解が難しい毒性化合物の分解をできることが知られている。本研究では、研究代表者が自ら開発を行ったリグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)への遺伝子導入システムを利用して、内分泌攪乱物質分解能が高度に高められた「遺伝子組換え担子菌」を作製する目的で、高分子基質や非フェノール性芳香族化合物をも直接分解することが可能な、多機能型のマンガンペルオキシダーゼを発現するための組換えmnp2遺伝子を形質転換導入して遺伝子組換え体を単離し、分解能が高められた株のスクリーニングを行った。ヒラタケのmnp2遺伝子を単離して、これまでに作成されたsdi1遺伝子の発現シグナルを有する組換えプラスミドpTM1上で、制限酵素的にコード領域の置き換えを行って組換えプラスミドpIpM2gの構築を行った。この発現プラスミドをP.ostreatusに導入するため、カルボキシン耐性マーカープラスミドpTM1との共形質転換を行った。選択薬剤としてカルボキシン2μg/mlを含む再生培地上でコロニーを作る形質転換体を単離した。これらの形質転換株に対しPCR法による検出を行い、mnp2発現プラスミドpIpM2gも導入された共形質転換株を42株単離した。このようにして得られた株を用いて、培地中に高分子色素PolyR-478を含む培養条件下で多機能型ペルオキシダーゼの生産能についてスクリーニングしたところ、野生型に比べて高い分解能を持つ組換え体が7株見つかった。

使用木质素降解能力（蘑菇亲戚）在环境中分解内分泌干扰物的系统的特征是它们具有针对其他生物体中未发现的各种污染物的有效性。据说在基础菌菌中，白色腐烂真菌可促进聚合物木质素的低分子量，这是由漆酶和细菌外分泌的漆酶和过氧化物酶最初产生的，从而分解并利用由此产生的各种芳族有机化合物。因此，众所周知，白色腐烂细菌可以分解细菌难以分解的有毒化合物，例如多环芳烃和杂环芳香族化合物以及高度碱基取代的芳族化合物。在这项研究中，研究人员开发的基因转移系统（Hillatake）（Hillatake）（Hillatake）（Hillatake）进行了自我开发，以产生“转基因修饰的基本菌”，并具有高度改进的内分泌干扰物降解。在这项研究中，基因转移系统用于产生“遗传改良的基础菌丝”，并高度改善内分泌干扰物的降解，并通过转化和引入重组MNP2基因来表达多官能杂质的杂种型和筛选的混合型杂种，从而隔离遗传重组，并引入重组MNP2基因，并引入遗传重组。分辨率提高。分离了日本百合鱼的MNP2基因，并通过在重组质粒PTM1上构建重组质粒PIPM2G，该酶的表达信号是先前生成的SDI1基因的表达信号。为了将该表达质粒引入骨p。p.ptm1，用羧抗抗性标记物质粒PTM1进行共转化。在含有2μg/mL羧二羧酸的再生培养基上定植的转化子作为选择性剂。通过PCR检测到这些转化的菌株，分离出42个共转化菌株，这也引入了MNP2表达质粒PIPM2G。使用这样获得的菌株，将细胞筛选出在培养基中包含聚合物染料Polyr-478的培养条件下产生多官能过氧化物酶的能力，并发现了七个具有高于野生型的分辨率的重组者。