高等真核生物の複製関連因子の探索とinsitu核内再構築

寻找高等真核生物中的复制相关因子和原位核重组

基本信息

批准号：
14014258
负责人：
水野武
金额：
$ 3.07万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014258/
关键词：
DNA複製 geminin Cdt1 Mcm 染色体複製複製開始因子 DNA結合タンパク質複製前複合体

项目摘要

高等真核生物の遺伝子は核内のreplication factoryと呼ばれる構造体に於いて複製される。しかし,巨大で複雑なゲノム構造を反映させながら核内の複製を検出する実験系は確立されておらず,複製研究の大きな障害となってきた。そこで、新規複製関連因子,特に核骨格とのリンクに関わる因子をDNAポリメラーゼ結合因子として探索し,replication factoryに関わる蛋自質の同定と性質解析,及びin situでの再構築を目指した。DNAポリメラーゼα、ε、ORC, MCM, Cdc45を含めた20種類以上の複製因子間の相互作用を酵母two-hybrid法を用いて検討した。ヒトMcm10及びマウスCdt1がORC, MCM4, MCM6, DNAポリメラーゼα等と相互作用する事を見出し、Mcm10、Cdt1を中心とした複製因子間の分子ネットワークを高等真核生物において始めて示唆する結果を得た。また、構築した様々なbaitを用いてマウス初期胚由来のcDNAライブラリーの検索を行った結果、機能未知因子に加え、多数の因子がポリメラーゼ、もしくは複製開始因子に結合するタンパク質として単離された。さらに、ヒストンデアセチラーゼ複合体の構成因子SAP18をDNAポリメラーゼεに結合する因子として同定した。SIN3-SAP18複合体がS期において複製装置複合体と巨大な複合体を形成する事も見出し、DNAポリメラーゼを含む複製装置複合体とヒストンデアセチラーゼ複合体との相互作用を示唆する興味深い知見となった。一方、マウスCdt1の機能解析の結果Cdt1のN末293アミノ酸が配列、構造に非特異的なDNA結合活性を有する事、その活性がgemininによって阻害されることを見出した。複製前複合体の分子構築の理解をうえで重要な知見となった。

较高的真核基因在核中称为复制工厂的结构中复制。但是，尚未建立实验系统来检测细胞核内的复制，同时反映了巨大而复杂的基因组结构，并已成为复制研究的主要障碍。因此，我们搜索了与复制相关的新型因素，尤其是与核主链相关的因素，作为DNA聚合酶结合因子，旨在鉴定和表征与复制因子有关的蛋白质，并重建它们的原位。使用酵母双杂交方法研究了20种类型的复制因子之间的相互作用，包括DNA聚合酶α，ε，ORC，MCM和CDC45。我们发现人MCM10和小鼠CDT1与ORC，MCM4，MCM6，DNA聚合酶α等相互作用，并发现了结果表明，在MCM10和CDT1的重复因子之间，这表明了较高的真核生物中的第一个与分子网络相互作用。此外，使用各种构造的诱饵搜索从早期小鼠胚胎中得出的cDNA库表明，除了未知的功能因素外，许多因子被分离为与聚合酶或复制起始因子结合的蛋白质。此外，组蛋白脱乙酰基酶复合物的组成型因子SAP18被确定为与DNA聚合酶ε结合的因子。还发现，SIN3-SAP18复合物在S相中具有复制装置复合物形成巨大的复合物，这是一个有趣的发现，表明复制装置络合物含有DNA聚合酶和组蛋白脱乙酰基酶复合物之间的相互作用。另一方面，小鼠CDT1的功能分析表明，CDT1的N末端293氨基酸具有非特异性的DNA结合活性，可用于序列和结构，并且它们的活性受到了双子素的抑制。这是理解恢复复合物的分子结构的重要发现。