自己分泌型がん細胞運動刺激因子の構造生物学的研究

自分泌癌细胞运动刺激因子的结构生物学研究

• 批准号: 13033037
• 负责人: 田中 信忠
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033037/
• 关键词: 構造生物学; 結晶構造解析; 結晶化; X線; 腫瘍; がん; サイトカイン; 転移

ヒト黒色腫細胞、ヒト繊維肉腫細胞から単離された、ヒト由来自己分泌型がん細胞運動刺激因子(human autocrine motility factor,以下hAMFと略)は、細胞外に分泌され、産生細胞自体の運動を刺激する、ホモ2量体(2x558アミノ酸残基)サイトカインである。本研究では、がん転移抑制剤の合理的デザインへ向けた手掛りを得るため、hAMFとその阻害剤との複合体の立体構造、およびhAMFの受容体である、hAMFRの立体構造を解明することを目指している。蒸気拡散法により、ポリエチレングリコール8000を沈殿剤として用い、組換え型hAMFの結晶化を行った。細い柱状結晶が再現性良く得られるようになった。筑波のフォトンファクトリーにおいて、回折強度データの収集を行い、1.9Å分解能までの回折強度データを得ることができた。得られた結晶の空間群はP2_12_12_1、格子定数はa=80.58Å,b=107.4Å,c=270.7Åであり、結晶の非対称単位中には4サブユニット(2分子の2量体:2x2x558アミノ酸残基)が含まれていた。結晶の溶媒含量は、47%であった。ウサギ由来ホスホグルコースイソメラーゼをサーチモデルとした分子置換法により位相を決定し、1.9Å構造精密化を行った。次いで、AMFとAMFのサイトカイン活性を阻害する阻害剤との複合体の立体構造を解明するため、数種の阻害剤との複合体結晶の調製を試みた。その結果、エリスロース4リン酸(E4P)との複合体結晶の調製に成功し、hAMF/E4P複合体の立体構造を2.4Å分解能で決定することができた。マウスAMF(mAMF)に関しても、大腸菌を用いた組換えタンパクの大量調製を行い、結晶化条件の探索を行った。その結果、mAMFに関しても、阻害剤フリーおよび数種の阻害剤存在下で、X線結晶構造解析に使える単結晶を得ることに成功した。

从人黑色素瘤细胞和人纤维肉瘤细胞中分离出的人类自分泌运动因子（以下称为HAMF）是一种同型二聚体（2x558氨基酸残基）细胞因子，细胞外分泌，并刺激生产细胞本身的运动。为了为癌症转移抑制剂的合理设计提供线索，本研究旨在阐明HAMF及其抑制剂之间复合物的构象，以及HAMF受体HAMFR的构象。重组HAMF通过使用聚乙烯乙二醇8000作为沉淀物来通过蒸气扩散结晶。现在，可以以极好的可重复性获得薄的柱状晶体。在Tsukuba的一个光子工厂收集衍射强度数据，并获得了高达1.9Å分辨率的衍射强度数据。所得晶体的空间组为p2_12_12_1，晶格常数为a =80.58Å，b =107.4Å，c =270.7Å，四个亚基（两个二聚体分子：2x2x5558氨基酸残基）包括在晶晶的Asmmetric单位中。晶体的溶剂含量为47％。通过使用兔衍生的磷酸葡萄糖异构酶作为搜索模型，通过分子替代确定了该相，并完善了1.9Å结构。接下来，为了阐明AMF和抑制AMF细胞因子活性的络合物的三维结构，我们试图用几种抑制剂制备复杂的晶体。结果，我们成功制备了具有4-磷酸盐（E4P）的复杂晶体，并以2.4Å分辨率确定了HAMF/E4P复合物的3D结构。对于小鼠AMF（MAMF），使用大肠杆菌制备大量重组蛋白来寻找结晶条件。结果，我们成功地获得了可用于X射线晶体结构分析的单晶体，并在有几种抑制剂的情况下使用。

项目成果

Uemura, H., et al.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of human autoerine motility factor"Protein and Peptide Lett. 8. 317-322 (2001)

Uemura, H., et al.：“人自体运动因子的结晶和初步 X 射线晶体学研究”蛋白质和肽 Lett。

Uemura, H., et al.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of human autocrine motility factor"Protein and Peptide Letters. 8. 317-322 (2001)

Uemura, H. 等人：“人类自分泌运动因子的结晶和初步 X 射线晶体学研究”蛋白质和肽快报。

Tsutsumi, S., et al.: "The enzymatic activity of phosphoglucose isomerase is not required for its cytokine function"FEES Lett.. 534. 49-53 (2003)

Tsutsumi, S. 等人：“磷酸葡萄糖异构酶的酶活性并不是其细胞因子功能所必需的”FEES Lett.. 534. 49-53 (2003)