自己分泌型がん細胞運動刺激因子の構造生物学的研究

自分泌癌细胞运动刺激因子的结构生物学研究

• 批准号: 13033037
• 负责人: 田中 信忠
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033037/
• 关键词: 構造生物学; 結晶構造解析; 結晶化; X線; 腫瘍; がん; サイトカイン; 転移

ヒト黒色腫細胞、ヒト繊維肉腫細胞から単離された、ヒト由来自己分泌型がん細胞運動刺激因子(human autocrine motility factor,以下hAMFと略)は、細胞外に分泌され、産生細胞自体の運動を刺激する、ホモ2量体(2x558アミノ酸残基)サイトカインである。本研究では、がん転移抑制剤の合理的デザインへ向けた手掛りを得るため、hAMFとその阻害剤との複合体の立体構造、およびhAMFの受容体である、hAMFRの立体構造を解明することを目指している。蒸気拡散法により、ポリエチレングリコール8000を沈殿剤として用い、組換え型hAMFの結晶化を行った。細い柱状結晶が再現性良く得られるようになった。筑波のフォトンファクトリーにおいて、回折強度データの収集を行い、1.9Å分解能までの回折強度データを得ることができた。得られた結晶の空間群はP2_12_12_1、格子定数はa=80.58Å,b=107.4Å,c=270.7Åであり、結晶の非対称単位中には4サブユニット(2分子の2量体:2x2x558アミノ酸残基)が含まれていた。結晶の溶媒含量は、47%であった。ウサギ由来ホスホグルコースイソメラーゼをサーチモデルとした分子置換法により位相を決定し、1.9Å構造精密化を行った。次いで、AMFとAMFのサイトカイン活性を阻害する阻害剤との複合体の立体構造を解明するため、数種の阻害剤との複合体結晶の調製を試みた。その結果、エリスロース4リン酸(E4P)との複合体結晶の調製に成功し、hAMF/E4P複合体の立体構造を2.4Å分解能で決定することができた。マウスAMF(mAMF)に関しても、大腸菌を用いた組換えタンパクの大量調製を行い、結晶化条件の探索を行った。その結果、mAMFに関しても、阻害剤フリーおよび数種の阻害剤存在下で、X線結晶構造解析に使える単結晶を得ることに成功した。

人自分泌运动因子 (hAMF) 是从人黑色素瘤细胞和人纤维肉瘤细胞中分离出来的，分泌到细胞外并刺激产生细胞本身的运动。它是一种同二聚体（2x558 个氨基酸残基）细胞因子，可刺激细胞的运动。在本研究中，我们将阐明hAMF与其抑制剂复合物的三维结构以及hAMF受体hAMFR的三维结构，为合理设计癌症转移抑制剂提供线索。旨在使用聚乙二醇8000作为沉淀剂，通过气相扩散法使重组hAMF结晶。现在可以获得具有良好再现性的薄柱状晶体。衍射强度数据是在筑波光子工厂收集的，我们能够获得分辨率为 1.9 Å 的衍射强度数据。所得晶体的空间群为P2_12_12_1，晶格常数为a = 80.58 Å，b = 107.4 Å，c = 270.7 Å，晶体的不对称单元包含4个亚基（2个二聚体分子：2x2x558个氨基酸）。残留物）也包括在内。晶体的溶剂含量为47％。以兔源性磷酸葡萄糖异构酶为搜索模型，通过分子置换法确定相，结构精修1.9 Å。接下来，为了阐明AMF与抑制AMF细胞因子活性的抑制剂之间的复合物的三维结构，我们尝试制备具有多种类型抑制剂的复合物晶体。结果，我们成功制备了赤藓糖4-磷酸（E4P）复合物晶体，并以2.4 Å分辨率测定了hAMF/E4P复合物的三维结构。对于小鼠AMF（mAMF），我们使用大肠杆菌制备了大量的重组蛋白并探索了结晶条件。结果，我们成功获得了 mAMF 单晶，可用于在不存在抑制剂和存在多种抑制剂的情况下进行 X 射线晶体结构分析。

项目成果

Uemura, H., et al.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of human autoerine motility factor"Protein and Peptide Lett. 8. 317-322 (2001)

Uemura, H., et al.：“人自体运动因子的结晶和初步 X 射线晶体学研究”蛋白质和肽 Lett。

Uemura, H., et al.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of human autocrine motility factor"Protein and Peptide Letters. 8. 317-322 (2001)

Uemura, H. 等人：“人类自分泌运动因子的结晶和初步 X 射线晶体学研究”蛋白质和肽快报。

Tsutsumi, S., et al.: "The enzymatic activity of phosphoglucose isomerase is not required for its cytokine function"FEES Lett.. 534. 49-53 (2003)

Tsutsumi, S. 等人：“磷酸葡萄糖异构酶的酶活性并不是其细胞因子功能所必需的”FEES Lett.. 534. 49-53 (2003)