原子レベルの立体構造に基づくチトクロム酸化酵素の動作機構の解明

基于原子级三维结构阐明细胞色素氧化酶的运行机制

基本信息

批准号：
11169233
负责人：
伊藤恭子
金额：
$ 13.12万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11169233/
关键词：
チトクロム酸化酵素 X線結晶構造解析反応中間体

项目摘要

チトクロム酸化酵素はミトコンドリア内膜呼吸鎖の末端酸化酵素で分子状酸素を水にまで還元するとともに膜の内側から外側へとプロトンの能動輸送を行う。この酵素の機能の解明のためには立体構造に関する情報が不可欠であるため、我々のグループではX練結晶構造解析を進めている。本酵素を真の意味で理解するためには酸化型だけでなく還元状態や配位子又は、阻害剤結合状態の異なる種々の酵素の水素の座標を含めた詳細な構造を明らかにする必要がある。本研究では結晶化条件、結晶の凍結方法等の改良を行うことにより酸化型では1.8Å分解能での構造が明らかにした。又、この酸化型結晶を各種溶液に浸せきさせることで還元状態や配位子結合状態の異なる結晶を低温捕捉した。これまでに、還元型1.9Å,CO結合型2.1Å,NO結合型2.1Å,CN結合型2.1Å,P型中間体1.86Å、F型中間体2.0Å分解能でのX線結晶構造を各々決定することに成功した。又、結晶用の分光器を作製したことによりこれらの結晶が各々の状態であることを直接結晶の吸収スペクトルを測定することによって確かめられるようになった。このようにまだ水素の位置を決定できるほどに精度は上がっていないものの、かなり詳細に構造の比較検討ができるようになった。酸化還元に伴って大きく変化することが認められたアスパラギン酸51のカルボキシル基がヘムaのプロピオン酸やアルギニン38を介して、マトリックス側から細胞質側へとプロトンを能動輸送するのに重要な働きをすることが新たに確かめられた。また、このカルボキシル基の変化はFTIRで我々の結晶標品を用いた得られた結果ともよく一致した。

细胞色素氧化酶是线粒体内膜呼吸链中的末端氧化酶，它将分子氧还原为水，并主动将质子从膜内转运至膜外。由于三维结构的信息对于阐明这种酶的功能至关重要，因此我们的小组正在进行 X 强度晶体结构分析。为了真正了解这种酶，有必要澄清各种酶的详细结构，包括氢坐标，这些酶不仅在氧化形式上有所不同，而且在还原态、配体或抑制剂结合状态上也有所不同。在这项研究中，通过改进结晶条件和晶体冷冻方法，以1.8 Å的分辨率阐明了氧化形式的结构。此外，通过将氧化晶体浸入各种溶液中，在低温下捕获了具有不同还原态和配体键合状态的晶体。到目前为止，我们已经确定了1.9 Å的还原形式、2.1 Å的CO键合形式、2.1 Å的NO键合形式、2.1 Å的CN键合形式、1.86的P型中间体的X射线晶体结构。 Å 和 2.0 Å 分辨率的 F 型中间体成功地做到了这一点。此外，通过制作晶体的分光计，可以通过直接测量晶体的吸收光谱来确认这些晶体处于各种状态。尽管精度尚未提高到足以确定氢的位置，但现在已经可以相当详细地比较和检查结构。天冬氨酸51的羧基已被证明会因氧化还原而发生显着变化，在质子通过血红素a的丙酸和精氨酸38从基质侧主动转运到细胞质侧方面发挥着重要作用。证实此外，羧基的这种变化与我们使用 FTIR 进行晶体制备所获得的结果非常一致。