Trp合成酵素βサブユニットのX線解析による複合体形成原理の解明

通过色氨酸合酶β亚基的X射线分析阐明复合物形成原理

• 批准号: 09261232
• 负责人: 森本 幸生
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261232/
• 关键词: トリプトファン合成酵素; 立体構造構築原理; X線解析

蛋白質の立体構造形成および四次構造形成のメカニズムを解明するために、大腸菌トリプトファン合成酵素αおよびβサブユニットのX線結晶構造解析を行った。αサブユニットの立体構造は、αβ複合体のものとほぼ同じであった。しかし、αサブユニットの表面電荷は、本来のαβ複合体のものとは異なり、また複合体のαサブユニットだけの場合とも一部異なる部分が存在した。これは複合体を形成することにより、分子表面の電荷分布が変化することを示している。立体構造的には主鎖および側鎖に大きな差異は見られなかったが、主鎖の揺らぎを示す温度起因では差が見られた。αサブユニット二重体では全体に温度因子が高いが、その中でも側鎖番号に沿って周期的に温度因子の高い領域が存在する。これらの部位はαサブユニットのTIMバレル構造の周期的に繰り返すα/βターンの部分である。このうち3カ所は、複合体形成時にβサブユニットを包み込むような配置となり、複合体での温度因子は極めて低い。すなわち大きな揺らぎはないと考えられる。一方、αサブユニット二重体ではこの部位を固定する相手を持たないため揺らぎが大きくなり、温度因子が高くなるものと考えられた。これらの潜在的な構造変化が酵素活性に大きく寄与しているものと考えられる。またαサブユニットの複合体形成時の相手方、つまりβサブユニット単独での構造解析を行うため培養・精製・結晶化を行った。野性型βサブユニット発現系をもつ大腸菌を培養し、最終精製にMonoQカラムを行い、蛋白濃度2%にて結晶化を行った。結晶化は0.2MCaCl2,HEPES-buffer pH7.5,5.28%PEG400の条件を中心に行った。その結果、約0.2x0.1x0.002mmの菱形板状結晶を得ることができた。結晶は複数枚張り付いたような結晶集合体であり、これを引き離し回折実験を行ったが、結晶が非常に小さいためか、回折反射は得られなかった。現在さらに良質の結晶が得られるように、大量精度を準備し、各種結晶化条件の検索を行っているところである。

为了阐明蛋白质构象和第四纪结构的机理，进行了大肠杆菌色氨酸合酶α和β亚基的X射线晶体结构分析。 α亚基的构象与αβ复合物的构象大致相同。然而，α亚基的表面电荷与原始αβ复合物的表面电荷不同，并且一些部分与单独的复合物的α亚基不同。这表明复合物的形成改变了分子表面上的电荷分布。尽管在三维结构方面，主链或侧链没有显着差异，但由于温度而观察到差异，这在主链中显示出波动。尽管温度因子通常在α-亚基二形式中很高，但有一些区域沿侧链数量有周期性的高温因子。这些位点是α亚基的TIM桶结构的循环重复重复的α/β转弯部分。这些位置中的三个被安排在形成复合物后β亚基包裹，并且复合物中的温度因子极低。换句话说，没有重大波动。另一方面，在α-亚基双体中，没有伙伴可以修复此部位，因此波动增加，温度因子增加。据认为，这些潜在的结构变化对酶活性有显着贡献。此外，为了在形成α-亚基复合物（即单独的β-亚基）时分析伴侣的结构，将结构培养，纯化和结晶。培养具有野生型β亚基表达系统的大肠杆菌，并使用Monoq柱进行最终纯化，并以2％的蛋白质浓度结晶。结晶主要是在0.2MCACL2，Hepes-Buffer pH 7.5和5.28％PEG400的条件下进行的。结果，获得了约0.2x0.1x0.002mm的钻石形板状晶体。晶体是将晶体组合在一起的晶体组合物，并通过分离来进行衍射实验，但没有获得衍射反射，也许是因为晶体很小。当前，准备大量精度，并正在寻找各种结晶条件，以获得更好的质量晶体。