アセチルコリン受容体とNa^+,K^+-ATPaseの細胞膜上での局在化の制御機構…ナノメートル計測-ピコニュートン操作法による1分子レベルでの解析による研究

细胞膜上乙酰胆碱受体和Na^+,K^+-ATP酶定位的控制机制...利用皮克顿操作方法进行单分子水平纳米测量和分析的研究

基本信息

批准号：
09257210
负责人：
楠見明弘
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257210/
关键词：
細胞骨格金コロイド光ピンセット Na^+K^+-ATPase

项目摘要

Na^+,K^+-ATPaseに金コロイドを抗体を介して結合させた。それらの運動を細胞の自由表面上で一分子レベルで観察し、さらに、光ピンセットを用いて牽引して、それに対する応答を調べた。その結果、約20%が細胞骨格結合型であること、約80%の分子は、細胞骨格非結合型で、膜骨格フェンスで仕切られたコンパートメント間をホップしていく様な拡散運動をしていることが示された。本研究に用いた上皮細胞MDCKは、1.8mM程度のCa^<2+>を含む通常の培養液中で培養すると細胞間に接着構造を形成する。Na^+,K^+-ATPaseは、細胞膜のラテラル面に局在する。ところが培養液のカルシウム濃度を50μM程度に下げると、接着構造は失われ、Na^+,K^+-ATPaseは細胞表面に一様に存在するようになる。再度、培養液のカルシウム濃度を通常のカルシウム濃度に戻すと(カルシウムスイッチと呼ぶ)、同期的に細胞間の強い接着が回復し、細胞は極性をもつようになり、Na^+,K^+-ATPaseは再びラテラル面に集合する。この集合の過程を1分子レベルで追跡することによって、集合の機構を解明することを目指した。しかし、2時間観察しても、追跡しているNa^+,K^+-ATPaseはなかなかラテラル面に移動しなかった。光の細胞毒性、金コロイドによるクロスリンクなどが原因と考えられ、現在、この問題の解決に全力をあげている。今後は、カルシウムスイッチによって誘起される、Na^+,K^+-ATPaseのラテラル面への集合を一分子レベルで追跡する、また、集合時に細胞からかかる力の性質を決定する、などを行い、これらによって、Na^+,K^+-ATPaseのラテラル面への局在化の機構を明らかにしたい。

胶体金通过抗体与 Na^+,K^+-ATPase 结合。在细胞自由表面上的单分子水平上观察它们的运动，并通过使用光镊拉动细胞来研究对此的响应。结果，约 20% 的分子与细胞骨架结合，约 80% 的分子与细胞骨架不结合，并进行在由膜骨架栅栏分隔的区室之间跳跃的扩散运动。。当在含有大约1.8mM Ca 2+ 的正常培养基中培养时，本研究中使用的上皮细胞MDCK在细胞之间形成粘附结构。 Na^+,K^+-ATP酶位于细胞膜的侧面。然而，当培养基中的钙浓度降低至约50μM时，粘附结构丢失并且Na^+,K^+-ATP酶均匀地存在于细胞表面上。当培养基中的钙浓度再次恢复到正常钙浓度时（称为钙转换），细胞间的强粘附同步恢复，细胞发生极化，Na^+,K^+ -ATPase在细胞表面重新组装。侧面。通过在单分子水平上跟踪这个组装过程，我们的目的是阐明组装机制。然而，即使经过2小时的观察，被追踪的Na^+,K^+-ATPase也不容易移动到侧面。据认为，光的细胞毒性和胶体金引起的交联是其原因，目前我们正在尽全力解决这个问题。未来，我们将在单分子水平上追踪钙开关诱导的Na^+,K^+-ATP酶在横向平面上的组装，并确定组装过程中细胞施加的力的性质。希望利用这些方法来阐明Na^+,K^+-ATPase 定位到侧面的机制。