Na^+/H^+イオン逆輸送担体の構造・機能と制御の多様性と統一性

Na^+/H^+离子反向传输载体结构、功能和控制的多样性和统一性

基本信息

批准号：
08268234
负责人：
金澤浩
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では細胞内におけるpH調節を含むイオン環境維持に極めて重要な役割を有し、生物界に広く存在するNa^+/H^+逆輸送担体蛋白質の構造と機能・制御の分子レベルでの理解を目指した。この輸送担体は特徴的な構造を有している。すなわち高等真核生物および原核生物を通じて10回内外の細胞膜貫通部分が存在する。一方高等真核生物では細胞膜ドメインに加えて細胞質に突出した部分が存在する。一次構造上は原核生物と真核生物で相同性はほとんどなく多様である。このような多様な構造がどのように機能と制御に関わっているのか、構造と機能の協関を明らかにする事が本研究の目的である。現在、次の3点に焦点をあてて研究を展開している。(1)大腸菌NhaA蛋白質の機能に必須な残基の同定:イオン輸送に関わる構造と機能の多様性と統一性を理解する第一歩として、細胞質ドメインを有さない、分子遺伝学的アプローチの簡単な大腸菌を材料として、Na+/H+逆輸送蛋白質NhaAの機能欠損変異株を分離し変異残基の同定、変異に伴う機能変換の解析から機能に必須な6残基を見いだした。特に133,163,164残基目のAspの重要性を見いだした。また、73と225残基目がH^+センサーとして機能する事を明らかにした。このほか7残基についても機能またはアセンブリーに重要であることを見いだした。この知見に基づきイオン輸送の経路となる残基の一旦を推定できた。現在この蛋白質の膜中でのトポロジーを解析中である。(2)ラットNHE1およびNHE3の細胞質ドメインに結合する蛋白質遺伝子のクローン化:ラットのNa^+/H^+逆輸送系のアイソフォームであるNHE1およびNHE3は細胞質に突出した部分を有し、細胞増殖シグナルによる活性発現制御を受けている。この制御機構を解明する一環としてこれらの逆輸送蛋白質の細胞質ドメインに結合する蛋白を蛋白質-蛋白質相互作用を指標に検索し、2種の蛋白質の存在を確認した。また酵母のTwo-hybrid法を用いて2種の新たな結合蛋白質の遺伝子のクローン化に成功し、CHP/No.18と名付けた。このうち1種は195残基からなる新規タンパク質であり、カルシニューリンBと高い相同性を有していた。現在これらの蛋白質の性質を解明するため、さらに一連の実験を行っている。(3)酵母(S.cerevisiae)の逆輸送蛋白質遺伝子の同定と機能解析:高等真核および原核生物の間に存在する下等真核生物のNa^+/H^+逆輸送蛋白質については遺伝子のクローン化が進んでおらず、多様性を理解する上で重要な対象と考えた。現在までにS.cerevisiaeの遺伝子を本年決定された全遺伝子塩基配列データバンクのなかから見出し、クローン化し構造を推定したところ、高等真核生物と同様細胞質ドメインを有しており、相同性は極めて低いことが見いだされた。すでにS.pombeでは細胞質を有さないNa^+/H^+逆輸送担体の存在があきらかだったので、進化上、酵母の近辺に細胞質を有するか否かの接点が存在すると考えられる。このような事実が制御の多様性と統一性にどのように関わっているのか明らかにするためには、さらに多くの下等真核生物の本逆輸送担体遺伝子のクローン化が必要であり、これを現在進めている。

在这项研究中，它在维持包括细胞的pH调节的离子环境中起着非常重要的作用，并且在生物学世界中广泛发现，以及在结构和功能的分子水平和控制载体的分子水平上理解。运输载体具有独特的结构。也就是说，通过高核和原代生物有10倍的细胞膜渗透。另一方面，在较高的桉术中，除了细胞膜结构域外，还有一个部分向细胞质突出。由于主要结构，几乎没有同源物质，具有主要生物和一个本地生物。这项研究的目的是阐明结构和功能之间的协作，这些不同的结构如何与功能和控制相关。目前，他正在研究以下三点研究。（1）鉴定大肠杆菌NHAA蛋白功能所需的残基：作为理解离子运输的结构和功能的第一步，没有细胞源性结构域的分子遗传方法。 Na+/H+RE转移蛋白NHAA功能功能障碍分离，我们发现六个残基对于与突变相关的函数转换分析中的功能至关重要。特别是，我们发现ASP在133,163,164的残留物中的重要性。它还揭示了73和225个残基充当H^+传感器。此外，我们发现七个残基对于功能或组装也很重要。根据这些知识，我能够估计AEON运输路线的残留物。我们目前正在膜上分析该蛋白质的拓扑结构。（2）蛋白基因与大鼠NHE1和NHE3细胞质结构域的结合：大鼠是大鼠的大鼠Na^+/H^+NHE1和NHE3，其部分具有细胞质突出的一部分通过增殖信号进行活性表达控制。作为该控制机制的一部分，搜索了蛋白质蛋白质互连的蛋白质，该蛋白与这些重新传输蛋白的细胞质结构域结合，并确认存在两种蛋白质。使用酵母两杂化方法，它成功克隆了两个新的结合蛋白，称为CHP/No.18。其中一个是一种由195个残基组成的新蛋白质，具有钙蛋白酶的高同源物。当前，正在进行一系列实验，以阐明这些蛋白质的性质。（3）酵母（伯氏菌）的鉴定和功能分析和功能分析：我认为这是高螺母和原始生物之间存在的低累积和原代生物的Na^+/H^+逆转蛋白是理解多样性的重要对象。迄今为止，在今年所有基因基因的所有基因的基因中都发现了菌链球菌的基因，当估计克隆和结构时，它的细胞原域是高度天然的立方体。已经在S. pombe中，没有细胞质的Na^+/H^+Re -Re -Re -Re -Re -Transport载体，因此认为是否存在接触点，无论是否在进化中酵母附近有细胞质。为了揭示这些事实如何参与控制的多样性和统一性，有必要将越来越多的款待的逆转载体基因归结为我们目前的进步。