遺伝子マーカーを用いた自家骨髄移植後の造血・免疫能再構築と再発起源細胞の解析

利用遗传标记分析自体骨髓移植后造血和免疫重建及复发源细胞

• 批准号: 07274226
• 负责人: 岸 賢治
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07274226/
• 关键词: 遺伝子導入; 自家骨髄移植; 遺伝子マ-キング; 造血幹細胞; 白血症; レトロ・ウイルス; HSV-TK遺伝子; ガンシクロビル

自家骨髄移植後の造血免疫能の再構築さらに腫瘍再発の起源細胞の解析を目的とし、移植細胞への遺伝子マ-キングを実施するための基礎検討を行った。正常ヒト骨髄よpannning法によりCD34陽性細胞を純化し、造血因子存在下に24-48時間液体培養した。Neo耐性遺伝子を含むレトロウイルスベクター培養上清を加え培養し、さらに導入効率を求めた。CD34細胞への遺伝子導入は造血因子存在下にベクターに暴露して24時間より増加し、上清との共培養時に遠心を加えることにより増強された。CFU-GMへの遺伝子導入は48時間の造血因子培養後ベクター上清とともに遠心後、48時間の培養が最適で導入効率は5.1-35.0%であった。単純ヘルペスウイルスのHSV-TK遺伝子導入細胞に対するGCVによる殺細胞効果を利用した遺伝子治療につき基礎検討を行った。GCVはHSV-TKによりリン酸化され、DNA合成阻害活性を示し、遺伝子導入癌細胞を障害する。HSV-TK遺伝子導入細胞(TK-K562)のGCVに対する感受性は、臨床投与時における最高血中濃度の1/10程度ですべて死滅した。一方、対象の非導入細胞では、GCVに抵抗性であった。遺伝子非導入K562とTK-K562の混在時のGCV処理は、TK-K562のみでなくK562に対する細胞障害を示し、いわゆるbistander効果を認めた。この効果は、軟寒天内の細胞非接触状態でも観察されたが、液体培養による細胞接触がより効果的で、cell to cell interactionが想定された。TK遺伝子導入とGCV処理による殺細胞作用のbistander効果を利用した自家移植の際に必要なpurging法として有用と思われるが、遺伝子マ-キング法による自家移植の有効性判定が必要とされる。

自体骨髓移植和对肿瘤复发起源的分析后的造血免疫能力的重建，我们进行了基本研究以对移植细胞进行基因。通过正常人骨髓的pan酸方法纯化CD34阳性细胞，并在存在造血因子的情况下被培养24-48小时。加入并培养了含有新耐药基因的逆转录病毒培养物上清液，并确定了进一步的引入效率。在存在造血因素的情况下，由于暴露于载体，基因转移到CD34细胞中24小时增加，并通过与上清液共培养期间通过离心增强。在将造血因子孵育48小时后，最佳地进行基因转移到CFU-GM中，然后与载体上清液离心，然后培养48小时，并引入效率为5.1-35.0％。我们利用GCV对单纯疱疹病毒的HSV-TK转染细胞的细胞杀伤作用进行了基础研究。 GCV通过HSV-TK磷酸化，表现出DNA合成抑制活性，并损害转基因癌细胞。 HSV-TK转基因细胞（TK-K562）对GCV的所有敏感性在临床给药时最高血液浓度的约1/10被杀。另一方面，该受试者的未转导细胞对GCV具有抗性。与无基因K562混合的非转导K562和TK-K562的GCV处理不仅显示细胞损伤，不仅对TK-K562，而且还显示出对K562的损害，并且观察到所谓的Bistander效应。即使在软琼脂内的非接触式细胞状态下也观察到了这种作用，但是液体培养的细胞接触更有效，并且假定细胞与细胞相互作用。它被认为是使用由TK基因转移和GCV治疗引起的细胞杀伤作用的自体移植所必需的清除方法，但是有必要使用基因标记方法确定自体移植的有效性。

项目成果

ken Toba: "Classification of cell cycle characterized with DNA/RNA quantitation using 7AAD/PY in hemopoietic malignancy" Experimental Hematology. (in press). (1996)

ken Toba：“在造血系统恶性肿瘤中使用 7AAD/PY 进行以 DNA/RNA 定量为特征的细胞周期分类”实验血液学。