筋および細胞骨格蛋白質の発生と心筋細胞の分化ならびにその異常

肌肉和细胞骨架蛋白的发育以及心肌细胞的分化及其异常

基本信息

批准号：
06274206
负责人：
嶋田裕
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.筋原線維形成過程におけるアクチンおよびミオシンの動態:ニワトリ胚心室筋由来の培養細胞に、ビオチン標識アクチンまたはミオシン軽鎖をmicroinjectionし、1分〜1時間後に抗ビオチン抗体および5nmコロイド金標識二次抗体で処理し(ある場合には銀増感も行った)、超薄切片を電子顕微鏡で観察した。アクチンを導入すると、筋原線維の近位部(末端以外の部分)ではそのA帯レベルの周辺が標識され、またミオシンを導入すると、I帯レベル(特にA-I接合部付近)が標識された。このことは、アクチンとミオシンの重合は、相互の蛋白質の存在下に起こることが考えられ、この機構で筋原線維の直径が増加することが考えられた。また筋原線維の遠位部(末端)では、終末筋節の終末アクチンフィラメントの存在する部位に両蛋白質の取り込みがみえ、この部において活発なフィラメント形成と代謝回転の起こっていることが考えられた。さらに、筋原線維の延長線上にも膜と密接な関係をもってアクチン分子が集合しているのがみえ、これは筋原線維の延長と、初期のアクチンフィラメント束の形成に関係していることが考えられた。2.心筋型トロポニンI(CTnI)cDNAの幼若骨格筋細胞への導入による筋原線維形成機構の解析:胚骨格筋細胞ではCTnIの発現はみられない。そこで培養幼若骨格筋細胞およびC2C12細胞にCTnIのcDNA(ほぼ全長)を導入(lipofection法)してCTnIを強制発現させることにより、筋原線維形成機構を解析した。導入した細胞をCTnI抗体で免疫蛍光染色すると、横紋のない線維束は反応したが、明らかな横紋のある筋原線維は反応しなかった。すなわち成熟筋原線維には、そこに本来(発生期にも、成熟しても)存在しないCTnIの取り込みを阻止または取り込まれたものを排除するような機構が存在すると考えられた。

1.肌原纤维形成过程中肌动蛋白和肌球蛋白的动态：将生物素标记的肌动蛋白或肌球蛋白轻链显微注射到鸡胚心室肌来源的培养细胞中，1分钟至1小时后，抗生物素抗体和5 nm胶体金将标记的两种注射到源自鸡胚心室肌的培养细胞中，在用以下抗体（在某些情况下是银敏化）处理后，在电子显微镜下观察超薄切片。当引入肌动蛋白时，肌原纤维的近端部分（末端除外）在A带水平周围被标记，而当引入肌球蛋白时，I带水平（特别是靠近A-I连接处）被标记。这表明肌动蛋白和肌球蛋白的聚合发生在彼此蛋白质存在的情况下，并且这种机制增加了肌原纤维的直径。此外，在肌原纤维的远端部分（末端），在末端肌节的末端肌动蛋白丝存在的部位观察到两种蛋白质的摄取，表明活跃的丝形成和周转发生在该部分。此外，肌动蛋白分子沿着肌原纤维延伸线与膜紧密结合，这被认为与肌原纤维的伸长和早期肌动蛋白丝束的形成有关。 2.将心肌肌钙蛋白I（CTnI）cDNA导入幼年骨骼肌细胞分析肌原纤维形成机制：胚胎骨骼肌细胞中未观察到CTnI的表达。因此，我们通过将CTnI cDNA（几乎全长）引入培养的年轻骨骼肌细胞和C2C12细胞（脂转染法）以强制CTnI表达来分析肌原纤维形成机制。当转染的细胞用 CTnI 抗体进行免疫荧光染色时，非横纹纤维束发生反应，但明显有横纹的肌原纤维却没有反应。换句话说，人们认为成熟的肌原纤维具有阻止摄取原本不存在的CTnI（在发育期间和成熟期间）的机制，或者消除摄取的CTnI。