PEPカルボキシラ-ゼアイソザイム遺伝子のシンク機能発現に伴う発現調節機構

PEP羧化酶同工酶基因库功能表达相关的表达调控机制

基本信息

批准号：
02261211
负责人：
泉井桂
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

植物においてホスホエノ-ルピルビン酸カルボキシラ-ゼ(以下PEPCと略)は多彩な生理的役割をもち,C4植物のトウモロコシでは少くとも3種類のアイソザイムが存在するが、それらのシンク機能の発現に伴ってどのように変化するかは知られていない。発現調節機構を分子レベルで解明するために,今年度はC4光合成に関与するPEPC遺伝子の5'上流域のDNA断片を用いて下記の二種類の実験を行い,有用な知見を得た。(1)タバコのトランスジェニック植物体を用いる実験。すでにクロ-ン化しているトウモロコシのPEPC遺伝子の転写開始点から上流へ約Ikbおよび4kbまでを含むDNA断片をマ-カ-酵素遺伝子βーグルクロニダ-ゼ)の上流につないだものを調製した。これをタバコの葉由来のプロトプラストに導入して形質転換したのち,個体を再生させた。得られた植物体の各組織についてマ-カ-遺伝子の発現を調べた結果,1kbと4kbではともに葉緑体を含む光合成細胞における遺伝子発現を指令するに充分な情報すなわちプロモ-タ-活性をもつことが分かった。(2)ゲルシフト法による核由来のDNA結合タンパクの検索。上記の1KbのDNA断井をさらに制限酵素で断片化し,それぞれについて,核タンパクとの結合能を調べた。その結果少なくとも3種類の核タンパク(MNF1,MNF2a,MNF2b)が見出され、それぞれDNAの繰り返し配列に結合することがわかった。これらの結合因子は緑葉や黄化葉にはみとめられたが,茎や根にはみとめられず,組織特異的発現に関与する因子である可能性が示唆された。さらに,MNF2aは光により,むしろ減少する傾向がみとめられ,PEPC遺伝子の光誘導に関係している因子である可能性が示吸された。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（以下简称PEPC）在植物中具有多种生理作用，而在C4植物玉米中，至少存在三种类型的同工酶，其如何变化尚不清楚。为了从分子水平阐明表达调控机制，今年我们利用参与C4光合作用的PEPC基因5'上游区域的DNA片段进行了以下两类实验，并获得了有用的发现。 (1)使用转基因烟草植物的实验。将已经克隆的玉米PEPC基因的转录起始位点上游含有约1kb和4kb的DNA片段连接到标记酶基因(β-葡萄糖醛酸酶)的上游。将其引入烟叶原生质体并转化后，个体得以再生。对获得的植物各组织中标记基因的表达进行了检查，结果发现1kb和4kb都含有足够的信息来指导包括叶绿体在内的光合细胞中的基因表达，即启动子活性。 (2)利用凝胶迁移法寻找来自细胞核的DNA结合蛋白。使用限制性内切酶将上述1Kb DNA片段进一步片段化，并检查每个片段与核蛋白结合的能力。结果，至少发现了三种类型的核蛋白（MNF1、MNF2a 和 MNF2b），每一种都被发现与重复的 DNA 序列结合。这些结合因子在绿叶和黄叶中发现，但在茎或根中没有发现，表明它们可能参与组织特异性表达。此外，观察到MNF2a因光而减少，这表明它可能是与PEPC基因的光诱导相关的因素。