光合成炭素代謝の統御に関与するプロテインキナーゼの探索とシグナル伝達の分子機構

寻找参与光合碳代谢控制的蛋白激酶及信号转导的分子机制

基本信息

批准号：
09274214
负责人：
泉井桂
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

[目的]光合成炭素代謝は、外的および内的環境の変化に呼応して、個体全体として巧みに統御されていると想像されるが、その実態および統御の分子機構には不明な点が多い。本研究ではC4光合成の律速酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)をとりあげ、1)種々の環境条件下における本酵素の可逆的リン酸化による活性調節の動態の解明、2)このリン酸化に関与するプロテインキナーゼ(PK)の同定とシグナル伝達機構の解明および、3)本酵素遺伝子の発現調節すなわち、転写やmRNAの安定性などの段階における調節機構の解明などを目指す。[結果・考察]1)リン酸化C4型PEPCとのみ特異的に反応するペプチド抗体の調製に成功し、これを用いて、明暗の変化によるリン酸化/脱リン酸化の変化の速度、夜間におけるリン酸化状態などを明らかにした。この抗体による免疫電顕ではリン酸化PEPCの細胞内局在性は検出できなかった。2)これまでに知られているすべての高等植物のPEPCはリン酸化を受けると推測されており、リン酸化部位周辺の保存配列は(E/D)(K/R)XXSIDAQLRである。部位特異的変異導入PEPCの利用により、上流の-3に位置する塩基性残基はPEPCリン酸化酵素にとって必須ではなく、この残基はリンゴ酸阻害感受性に寄与していることがわかった。この基質特異性を利用したリン酸化酵素の精製を進めている。3)PKのcDNAクローンとしては、CDPKが2種、CDPK-related PKが2種CDPK関連新規PKが1種得られ、一部は組換え体を調製したが、PEPCのリン酸化能はSyntide-2の数十分の一であった。さらにPVPK、MAPK、ABAPKの部分cDNAを得た。

[目的] 光合碳代谢被认为是在整个个体中巧妙地调节以响应外部和内部环境的变化，但其实际状态和控制的分子机制仍有许多未知之处。本研究重点关注磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPC)，它是 C4 光合作用中的限速酶，旨在 1) 阐明该酶在各种环境条件下通过可逆磷酸化进行活性调节的动态，2) 阐明我们的目的是鉴定参与这种磷酸化的蛋白激酶（PK）并阐明信号转导机制，以及3）调节该酶基因的表达，即阐明转录和mRNA稳定性等阶段的调节机制。 [结果/讨论] 1) 我们成功制备了仅与磷酸化 C4 型 PEPC 发生特异性反应的肽抗体，并使用该抗体，我们研究了光和暗变化引起的磷酸化/去磷酸化的变化率以及磷酸化夜间的氧化态得以澄清。使用该抗体的免疫电子显微镜无法检测到磷酸化 PEPC 的细胞内定位。 2）假设目前已知的所有高等植物的PEPC均发生磷酸化，磷酸化位点周围的保守序列为(E/D)(K/R)XXSIDAQLR。使用PEPC的定点诱变，我们发现上游-3碱性残基对于PEPC激酶不是必需的，并且该残基有助于苹果酸抑制敏感性。我们正在利用这种底物特异性来纯化磷酸化酶。 3) PK cDNA克隆，获得2种CDPK、2种CDPK相关PK、1种CDPK相关新型PK，其中部分为重组体，但PEPC的磷酸化能力由Syntide测定- 是 2 的零点几。此外，还获得了PVPK、MAPK和ABAPK的部分cDNA。