プロテインキナ-ゼC群の分子多様性及びその構造と機能の分子生物学的解析

蛋白激酶C基团的分子多样性及其结构和功能的分子生物学分析

• 批准号: 01641543
• 负责人: 大野 茂男
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01641543/
• 关键词: プロテインキナ-ゼC; カルシウムイオン; ホルボ-ルエステル

前年度までにPKC群各分子種についてCOS細胞におけるcDNA発現系を用いて種々の生化学的性質の検討を行なってきた。その過程でnPKCεが従来のPKC(α,β,γ)とは質的に異なる新しい蛋白質である事を明らかにした。本年度はこれをさらにおし進め、キナ-ゼの基質特異性、細胞膜との相互作用、down-regulation等について各分子種の比較を行ない、明確な差のある事を見い出した。同時に各分子種のcDNAを3Y1細胞に導入する系を用いて生細胞レベルでの機能をその転写活性化能を指標として検討し、各PKC,nPKC分子種間に大きな差異のある事を見い出した。以下順を追って述べる。1.COS細施のcDNA発現系を用いて精製したPKCα,nPKCεとを用いて種々の精製蛋白質に対するリン酸化能を試験管内で検討した。その結果多くのPKC基質がnPKCεの基質にもなる事が明らかとなった。一方徴小管結合蛋白質群(MAPs)の一つtの分画に混在する蛋白(p140)がnPKCεによってのみきわめて効率よくリン酸化される事を見い出した。2.PKC,nPKCをoverexpressionさせた細胞を用いてホルボ-ルエステル処理後の各分子種の細胞内での動態を検討した結果、nPKCεについても細胞膜への移行、down-regulationという現象の起る事が明らかとなった。しかしその速度、様式は異なっていた。試験管内での細胞膜との結合実験においてPKCとnPKC間でそのco-factor依存性の明確な差のある事が確認された。3.ホルボ-ルエステル応答性遺伝子の転写活性化能をPKC,nPKCについて生細胞レベルで検討した結果、各分子種間でその遺伝子特異性に明確な差が認められた。以上を総合するとPKC,nPKCε各分子種は細胞内で異なった生理機能を担っている事が示された。

直到上一年，使用COS细胞中的cDNA表达系统研究了PKC组每个分子种类的各种生化特性。在此过程中，揭示了NPKCε是一种与常规PKC（α，β，γ）质量不同的新蛋白质。今年，我们今年进一步晋升，比较了奎宁酶的底物特异性，与细胞膜，下调和其他因素的相互作用，并发现明显的差异。同时，我们使用一个系统使用一个系统研究了每个分子物种的cDNA，将其转录激活能力作为指数引入3Y1细胞，并发现PKC和NPKC分子物种之间存在显着差异。以下将按顺序解释。 1。使用PKCα和NPKCε在体外研究了各种纯化蛋白的磷酸化能力，并使用COS细涂层cDNA表达系统纯化。结果，已经揭示了许多PKC底物也可以是NPKCε的底物。另一方面，发现蛋白质（p140）在其中一种构造小管结合蛋白（MAP）中混合的蛋白质（p140）被NPKCε极有效地磷酸化。 2。在使用已用PKC和NPKC过表达的细胞处理后，检查了每个分子物种的细胞内动力学后，据揭示了NPKCε还经历了细胞膜和下调的迁移。但是，速度和样式不同。在体外与细胞膜结合的实验中，已经证实，PKC和NPKC之间的co因子依赖性存在明显差异。 3。在活细胞水平上检查了Holborose响应基因对PKC和NPKC的转录激活的能力，并且在分子物种之间观察到了其基因特异性的明显差异。综上所述，PKC和NPKCε分子物种在细胞内具有不同的生理功能。

项目成果

Akiko Hata: "Direct evidence that the kinase activity of protein kinase C is involved in transcriptional activation through a TPA-responsive element." FEBS Lett.252. 144-146 (1989)

Akiko Hata：“直接证据表明蛋白激酶 C 的激酶活性通过 TPA 响应元件参与转录激活。”

Yasuhiko Konno: "Enzymatic Properties of a phorbol ester receptor/protein kinase distantly related to the protein kinase C family" J.Biochem. 106. 673-678 (1989)

Yasuhiko Konno：“与蛋白激酶 C 家族密切相关的佛波酯受体/蛋白激酶的酶学特性”J.Biochem。

Yoshiko Akita: "Expression and properties of two distinct classes of the phorbel ester receptor family,four conventional protein kinase C types and a novel protein kinase C." J.Biol.Chem.265. 354-362 (1990)

Yoshiko Akita：“两种不同类型的佛贝尔酯受体家族的表达和特性，四种传统的蛋白激酶 C 类型和一种新型蛋白激酶 C。”

大野茂男: "生化学" 日本生化学会, (1989)

大野茂夫：《生物化学》日本生化学会，（1989）

Hitoshi Wada: "Cell-type-specifec expression of the genes for the protein kinase C family" Biochem.Biophys.Res.Commun.165. 533-538 (1989)

Hitoshi Wada：“蛋白激酶 C 家族基因的细胞类型特异性表达”Biochem.Biophys.Res.Commun.165。