1型糖尿病の発症に関わる転写因子T-betの機能解析とその転写制御に関する研究

1型糖尿病发病相关转录因子T-bet的功能分析及其转录调控研究

• 批准号: 14570751
• 负责人: 黒丸 龍一
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14570751/
• 关键词: T-bet; 1型糖尿病; 遺伝子多型; 転写活性

T-bet遺伝子His33Gln多型による転写活性の変化我々は以前の研究で1型糖尿病とT-bet遺伝子His33Gln多型の関連を解析した。その結果、日本人1型糖尿病群においてはGln33多型の頻度がコントロール群と比較して統計学的に有意に高いということをはじめて発見した。今回あらたに、T-bet遺伝子His33Gln多型が日本人1型糖尿病の発症に影響を与える分子機序を明らかにするため、同遺伝子多型にともなうT-betタンパク質の転写活性の変化を検討した。まず、健常人ボランティアより末梢血リンパ球を分離、培養後、刺激にて活性化しRNAを抽出た。RT-PCR法によりT-bet遺伝子のタンパク翻訳領域を増幅し、つぎにPCR産物をc-Mycとの融合タンパクとして発現できるベクターpCMV-Tagにサブクローニング後、シークエンス法によりHis33とGln33多型のクローンを選別した。2種類のT-bet(T-bet His33とT-bet Gln33)を発現するプラスミド(pTbet-His33およびpTbet-Gln33)を作成するとともに、T-boxタンパク質が結合するDNA塩基配列を有するIFNγ遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子翻訳領域を挿入したIFN-γルシフェラーゼリポータープラスミドを準備した。それぞれのT-bet発現プラスミド(T-bet His33またはT-bet Gln33)とともにIFN-γルシフェラーゼリポータープラスミドをHeLa細胞にリポフェクション法にて導入し、12時間後にそれぞれの転写活性をデュアル・ルシフェラーゼアッセイ法で解析した。その結果、T-bet Gln33はT-bet His33よりも有意に高い転写活性を示した(p=0.0001、Student's t検定)。このことは、T-bet遺伝子His33Gln多型がIFN-γ遺伝子の発現に影響を与える機能的多型であることを示している。すなわち、T-bet Gln33多型は、T細胞におけるIFN-γ発現を誘導する機序を介して日本人の1型糖尿病の発症に関与しているものと考えられる。

T-bet基因His33GLN多态性的转录活性变化我们分析了1型糖尿病与T-bet基因HIS33GLN多态性之间的关联。结果，我们首先发现与对照组相比，日本1型糖尿病组的GLN33多态性频率在统计学上明显更高。为了阐明T-bet基因His33GLN多态性影响日本1型糖尿病的发展的分子机制，我们研究了与相同基因多态性相关的T-bet蛋白转录活性的变化。首先，将外周血淋巴细胞与健康的志愿者分离，培养，然后刺激以激活并提取RNA。通过RT-PCR方法扩增了T-BET基因的蛋白质翻译区域，然后将PCR产物亚克隆到矢量PCMV-TAG中，该媒介物可以用C-MYC表示为融合蛋白，然后用His33和GLN33多态性的克隆来表达，并通过测序方法选择。制备了表达两种类型的T-bet（T-Bet His33和T-Bet GLN33）的质粒，并制备了IFN-γ荧光素酶报道质粒，制备了在其中将荧光素酶基因翻译区域插入下游的IFNγ基因启动子的下游，具有T-Box蛋白结合的IFNγ基因启动子启动子序列。 IFN-γ荧光素酶报道质粒以及每个T-bet表达质粒（T-BET HIS33或T-BET GLN33）通过脂肪触发引入HELA细胞，在12小时后，通过双荧光素酶测定法分析了相应的转录活性。结果，T-BET GLN33的转录活性明显高于T-BET HIS33（P = 0.0001，Student's T-Test）。这表明T-bet基因HIS33GLN多态性是影响IFN-γ基因表达的功能多态性。换句话说，T-BET GLN33多态性被认为与诱导T细胞中IFN-γ表达的机制有关日语中1型糖尿病的发展。